分子病態部は4つの研究室から構成される。各研究室は協力し合い、循環器疾患の克服に向けて、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法を用いて研究を進めている。主に、止血および血栓形成に関する研究、循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究、脳循環代謝に関する研究を行っている。

1. 止血および血栓形成に関する研究


1. 血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に関する研究
   血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP）は多数の細小血管に血小板血栓が生じる難病である。血漿タンパク質フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; VWF）を切断する酵素ADAMTS13の活性が失われることで、超高分子量VWFマルチマーが増加し、血小板の過剰凝集につながる。我々は、ADAMTS13遺伝子解析、活性測定法開発、構造機能解析、遺伝子改変マウス作製・解析などを行ってきた。先天性TTP患者の遺伝子解析における日本の拠点施設として、奈良県立医科大学と協同してこれまで50家系以上を解析している。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   静脈血栓塞栓症の発症には遺伝的背景が関わっている。我々は、日本人の約55人に１人の頻度で見られるプロテインＳ-K196E変異が静脈血栓塞栓症のリスク要因であることを明らかにし、変異保有者のプロテインＳ抗凝固活性は平均で約16％低いこと、日本人特有の変異であることなどを報告してきた。この変異を含め、日本人に見られる血栓性素因の研究を行っている。
3. 血小板凝集機構に関する研究
   正常な止血反応と病的な血栓形成のいずれにおいても、血小板凝集は重要な役割を果たす。血小板表面に存在する種々の受容体のうち、インテグリンは安定な血小板血栓の形成に寄与し、その活性化およびシグナル伝達機構の解明は、抗血小板薬の開発に結びつく。我々はゲノム網羅的変異を導入する手法により、血小板のインサイドアウトシグナルに関わる因子としてILKを同定した。現在、より詳細なメカニズムの解明をめざす研究を進めている。
4. 後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
   VWFは止血初期段階の血小板凝集において重要な血漿タンパク質である。巨大マルチマー構造を形成し、そのサイズが大きいほど血小板凝集能は高い。種々の機構でVWFの活性は調節されており、VWFの活性低下は出血性疾患の原因となる。近年、大動脈弁狭窄症や補助人工心臓装着の患者に見られる重篤な消化管出血に後天性von Willebrand症候群（acquired von Willebrand syndrome; AVWS）が関与すると考えられるようになってきたが、そのメカニズムは十分に分かっていない。我々は、AVWSにおけるVWFマルチマーの動態と出血の関連性についての研究を行っている。
5. 血栓症に関わる臨床研究
   周産期･婦人科部および臨床検査部と共同で、血栓性素因に関する研究、妊娠時ヘパリン療法による抗凝固療法モニタリングに関する研究、新規経口抗凝固薬の凝固系マーカーへの影響の検討、急性期脳卒中の診断・病態解明のための血中バイオマーカ―の探索、ヘパリン起因性血小板減少症に関する研究などを進めている。


2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究


1. 小胞体ストレスに関する研究
   我々は、血管内皮障害性因子ホモシステインで発現誘導されるタンパク質としてHerp等を発見し、これらに関する研究を継続している。Herpは小胞体ストレスで強く発現誘導される小胞体膜タンパク質であり、主に小胞体関連タンパク質分解（ERAD）で機能する。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などで見られる現象である。Herp、Derlin-1、Derlin-3の各遺伝子欠損マウスを作製し、それらの表現型を解析した。現在、HerpおよびDerlin群の機能解明に向けた研究を継続している。
2. VWF産生機構に関する研究
   VWFは血管内皮細胞で合成され、血中に分泌される。その分泌には、一般に見られる分泌小胞を介した経路と、Weibel-Palade小体と呼ばれる血管内皮細胞特異的なオルガネラに一旦貯蔵された後に分泌される、二つの経路がある。我々は、生体内の血管内皮細胞に近い構造をもつように極性培養した血管内皮細胞を用いて、特にVWFの細胞内輸送に焦点をあて、その産生・分泌機構について研究を進めている。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   血漿タンパク質には、血中プロテアーゼにより分解されるだけでなく、マクロファージや肝実質細胞表面上の受容体と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ分解されるものが存在する。我々は、血小板血栓形成能を抑制的に制御するVWF切断酵素ADAMTS13のクリアランス機構の解明を目指した研究を行っている。
4. 血漿タンパク質産生におけるエピジェネティック修飾に関する研究
   複雑な止血系において、関連する血漿タンパク質の血中濃度の寄与も少なくない。血液凝固因子の増加と凝固制御因子の減少は血栓症のリスクに、その逆は出血症のリスクになり得る。タンパク質の産生はエピジェネティック修飾によっても調節される。そこで、主にVWFとADAMTS13を対象として、エピジェネティック修飾の役割を調べている。


3. 脳循環代謝に関する研究

脳血管攣縮の成因の解明、虚血性脳卒中時に生じる虚血性ペナンブラ領域の病態解明、一過性局所脳虚血モデルの開発、虚血耐性の誘導と認知症の予防や改善効果を有する脳由来神経栄養因子BDNFの脳内産生を促進させる医療機器の開発、およびBDNF産生促進物質の探索を行っている。独自に開発した局所脳虚血モデルでは、再現性の高い治療効果の判定法として有用なラット局所脳虚血モデルを発表し（2001年）、その後、マウスモデルへと発展させた（2003年）。行動解析に関しては、各個体の記憶学習能を定量化でき、独自の改良を加えた、除外動物に必要のない水迷路変法を開発した（2006年）。マウス脳虚血モデルは、その後の各種ノックアウト動物の神経脆弱性の判定に用い、脆弱性関連遺伝子を報告した（2011年、2012年）。脳虚血マウスは、その後、無血外科操作によって作成可能となり（2014年）、虚血負荷後の脳梗塞巣の再現性向上と致死率の極限までの低下に成功した。1998年の見出した連続的な拡延性抑制現象が脳内BDNFを増加させ、脳梗塞体積を縮小させる現象をきっかけに着手した、脳内BDNFの安全な産生増加法の研究では、特定の電圧レベル帯を有する電位刺激が脳内のBDNF産生を促進し、脳梗塞を縮小させ（2005年）、記憶力を増強させることを見出した（2008年）。さらに、虚血耐性誘導時の観察において、脳皮質表面（軟膜下層）に神経幹細胞様動態を示すグリア系細胞の活性化と、その後の神経新生現象を世界に先駆けて発見した（2009年）。脳血管攣縮の成因解明に関しては、血管炎に集積するマクロファージから産生される血小板由来成長因子PDGFが遅発性の血管収縮を生じさせ、脳血管攣縮の原因と成り得ることを示した（2011年）。また、既存薬剤の脳保護作用の探索に関して、Ⅱ糖尿病薬（DPP-4阻害剤、ネシーナ）が脳内BDNFの産生を促進し、脳保護作用を示すこと（2013年）、特定電圧の生体（ヒト）への印加刺激が、緩やかな抗肥満効果を示すこと（2013年）、慢性疼痛治療剤ERV（REV:ノイロトロピン）が脳梗塞耐性を誘導し、記憶学習能を向上させること（2015年）、適切な高電位治療がマウス脳内のBDNFを増加させるとともに、neuronal calcium sensor-1 (NCS-1)の発現とCaMKII-αのリン酸化を増強させること（2017年）、また、活性化プロテインＣが脳保護作用を示し、これまで報告されていない極めて低用量側に至適用量が存在することを報告した（2017年）。

1. 止血および血栓形成に関する研究


1. 血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に関する研究
   これまでに引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、国内外で未報告の変異を複数同定するとともに、診断に対するサポートを行った。また、厚労科研費研究班のメンバーとして、TTP診療ガイド2017を作成した。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   静脈血栓塞栓症の遺伝的要因として、プロテインＳ-K196E変異がある。日本人によく見られるリスク変異であり、その有無を知ることは血栓症予防の点で重要である。我々は、遺伝子解析を行わずに変異の有無を判別できる検査法を確立したので（特許出願済）、知的資産部および国内企業と協同して、実用化を視野に入れた共同研究開始に着手した。これと平行して、静脈血栓塞栓症の原因となる遺伝子変異の探索も進めた。
3. 血小板凝集機構に関する研究
   血小板凝集機構を解明することは、動脈閉塞症等を理解し、その予防法や治療法を開発するために重要である。我々は発現クローニングの手法を用いて血小板凝集反応にかかわる因子の単離同定を進め、血小板インテグリンの活性化を制御するILKを同定し、詳細な分子機構を2013年に報告した。以後も本研究を発展的に継続させており、今年度は、ILK結合タンパク質の一つであるキンドリン-3の機能発現におけるドメイン構造の役割を検討した。
4. 後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
   AVWSの病態解析に必要となる、血中の超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大学および奈良県立医科大学と協同し、VWFマルチマー解析法を標準化し、その結果を評価した。その中で、VWFマルチマー解析に用いる血漿量が解析結果に大きな影響を与えることを明らかにした。AVWSの重症度の指標として、血漿量と抗原量のどちらに合わせて解析するのが適しているかを、今後調べる必要がある。同じ試料の反復解析による評価では、解析結果に高い再現性がみられ、安定して値を得られる方法になったことを確認できた。高い施設間相関性も実現した。


2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究


1. 小胞体ストレスに関する研究
   低酸素ストレスに対して脆弱性を示すHerpおよびDerlin-3欠損マウスを利用しながら、HerpおよびDerlin-3が関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解（ERAD）の研究を継続している。今年度、HerpおよびDerlin-3の低酸素に対する脆弱性の分子メカニズムを調べるため、心臓生理機能部および創薬オミックス解析センターとの共同研究として、RNA-seqによる遺伝子発現の網羅的解析を実施した。現在、得られた結果の詳細な解析を開始したところである。また、画像診断医学部との共同研究としてMRIによる心機能評価を行った結果、Herp欠損マウスおよびDerlin-3欠損マウスにおいて心臓の収縮異常による機能低下が明らかとなった。現在、発症時期を特定するために、出生後からの経時的なMRI解析を進めている。
2. VWF産生機構に関する研究
   高密度敷石状に培養したヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いて、VWFの合成および分泌メカニズムの解明を目的に研究を行っている。VWFはWeibel-Palade小体と呼ばれる血管内皮細胞に特異的なオルガネラに貯蔵されている。同オルガネラはpH 5.4の酸性オルガネラであり、その酸性環境がVWFの機能発現に重要であると考えられているが、その責任分子は明らかにされていない。我々はプロトンポンプV-ATPaseが候補分子の一つであることを見出した。V-ATPase活性を抑制するとWeibel-Palade小体はオルガネラ構造を維持できなくなり、分泌に伴って形成されるVWF stringsと呼ばれる超高次構造も適正に形成されなくなった。現在、さらに詳細な解析を進めている。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   マクロファージ形質膜表面に存在するタンパク質受容体CD163およびSIGLE5をHEK293細胞上に発現させ、ADAMTS13の取り込みを観察した。その結果、ADAMTS13のクリアランスに関与すると最近報告されたCD163の発現細胞よりも、SIGLEC5発現細胞の方がADAMTS13のMDTCSドメイン領域を高効率で取り込むことを観察した。取り込みは時間依存的に増強し、取り込まれたMDTCSは初期エンドソームマーカーのEEA1と共局在した。また、MDTCSは細胞表面のSIGLEC5受容体に結合することを確認した。したがって、ADAMTS13のクリアランスにSIGLEC5が関与すると考えられる。現在、SIGLEC5の細胞外ドメイン領域を調製し、MDTCSとの相互作用を検証している。
4. 血漿タンパク質産生におけるエピジェネティック修飾に関する研究
   VWFの主要な産生源である血管内皮細胞におけるVWF発現に対するDNAメチル化の影響を調べた。HUVEC培養系でのVWF発現量は細胞が密に接着して敷石上になるとともに劇的に増加した。VWF遺伝子プロモータ領域にある８ヶ所のCpGのメチル化をバイサルファイト処理によって調べたところ、VWF非発現細胞に比べて培養初期から低メチル化状態であった。能動的なDNA脱メチル化過程を調べるため、現在、脱メチル化の初期過程であるヒドロキシメチル化を検証中である。一方、ADAMTS13は主に肝星細胞で産生される。ヒト肝星細胞の初代培養系においてADAMTS13発現量および分泌量は培養日数依存的に増加した。現在、星細胞におけるADAMTS13遺伝子プロモータ領域のメチル化レベルをバイサルファイト処理によって検証している。


3. 脳循環代謝に関する研究

臨床薬として、深部静脈血栓症、急性肺血栓塞栓症、電撃型紫斑病に対する政府認可を得ているヒト血液製剤を、独自に開発したマウス局所脳虚血（3血管閉塞）モデルの急性期静脈内投与によって、虚血時の脳血流には影響を与えず、慢性期のマウス脳梗塞を縮小させ、脳神経脱落症状を改善させることを見出していたが、同薬剤の有する抗凝固作用による出血性梗塞の発症率がゼロではなく、さらなる低用量の有効性を解析した結果、臨床的使用量に通じる低用量にて、副作用なく強い脳保護効果を示すことを明らかとした。同結果は、日本神経科学学会、米国神経科学学会および日本脳循環代謝学会にて報告した。
Neuronal calcium sensor-1 (NCS-1)欠損マウスを用い、独自の水迷路試験を用いて解析を行った結果、同欠損マウスの記憶力は、正常（ワイルド）マウスよりも劣っていることが明らかとなり、解剖学的な神経構築は保たれているものの、脳内BDNFが低値であり、長期増幅やBDNFの増加シグナルを担うことが知られるCaMKII-αのリン酸化が抑制されること、および、dopamineの発現が抑制されることを明らかとした。電子顕微鏡を用いた神経細胞構築の観察では、前シナプスに位置するdense core vesiclesが減少していたことより、NCS-1が欠損することで、脳内BDNFが低下し、前シナプス構造に負の影響を及ぼし、記憶力が低下することを明らかとした。さらに、脳内BDNFを増加させる機能を有する高電位刺激（上記）が、NCS-1とCaMKII-α量を増加させることを明らかとし、NCS-1とdopamineの発現、および、CaMKII-αのリン酸化とBDNFは、記憶力の制御に関する関係性が示された。この研究の結果は、PLOS ONE に報告した。

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