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分子病態部

2016年の業績

研究活動の概要

分子病態部は四つの研究室から構成される。各研究室は協力し合い、循環器疾患の克服に向けて、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法を用いて研究を進めている。主に、止血および血栓形成に関する研究、循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究、脳循環代謝に関する研究を行っている。

  1. 止血および血栓形成に関する研究

    1. 血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)の研究
      TTPは多数の細小血管に血小板血栓が生じる難病である。フォンビルブランド因子(VWF)切断酵素ADAMTS13の活性が失われることで、超高分子量VWFマルチマーが増加し、血小板の過剰凝集につながる。我々は、ADAMTS13遺伝子解析、活性測定法開発、構造機能解析、遺伝子改変マウスの作製・解析などを行ってきた。先天性TTP患者の遺伝子解析における日本の拠点施設として、奈良医大と協同してこれまで50家系以上を解析している。
    2. 非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome; aHUS)の研究
      aHUSはTTPと同様に血栓性微小血管障害症(thrombotic microangiopathy; TMA)に属する疾患であり、半数以上の症例に補体系因子の遺伝子異常が見られる。我々は厚労科研費研究班を通して、aHUS患者の遺伝子解析拠点施設として機能している。
    3. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因の研究
      静脈血栓塞栓症の発症には遺伝的素因が関わっている。我々は、日本人の約55人に1人の頻度で見られるプロテインS-K196E変異が静脈血栓塞栓症の遺伝的素因であることを明らかにし、変異保有者のプロテインS抗凝固活性は平均で約16%低いこと、日本人特有の変異であることなどを報告してきた。この変異を含め、日本人に見られる血栓性素因の研究を行っている。
    4. 血小板凝集機構の研究
      正常な止血反応と病的な血栓形成のいずれにおいても、血小板凝集は重要な役割を果たす。血小板表面に存在する種々の受容体のうち、インテグリンは安定な血小板血栓の形成に寄与し、その活性化およびシグナル伝達機構の解明は、抗血小板薬の開発に結びつく。我々はゲノム網羅的変異を導入する手法により、血小板のインサイドアウトシグナルに関わる因子としてILKを同定した。現在、より詳細なメカニズムの解明をめざして研究を継続している。
    5. 後天性von Willebrand症候群(acquired von Willebrand syndrome; AVWS)の研究
      VWFは止血反応の初期段階である血小板凝集において重要な血漿タンパク質である。巨大マルチマー構造を形成し、そのサイズが大きいほど血小板凝集能は高い。VWFの産生・放出、ADAMTS13による切断など、種々の機構でVWFの活性は調節されており、VWFの活性低下は出血性疾患の原因となる。近年、大動脈弁狭窄症や補助人工心臓装着の患者に見られる重篤な消化管出血にAVWSが関与すると考えられるようになってきたが、そのメカニズムは十分に分かっていない。我々は、AVWSにおけるVWFマルチマーの動態と出血の関連性についての研究を行っている。
    6. 血栓症に関わる臨床研究
      周産期婦人科および臨床検査部と共同で、血栓性素因に関する研究、妊娠時ヘパリン療法による抗凝固療法モニタリングに関する研究、新規経口抗凝固薬の凝固系マーカーへの影響の検討、急性期脳卒中の診断・病態解明のための血中バイオマーカーの探索、ヘパリン起因性血小板減少症に関する研究などを進めている。

  2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究
    1. 小胞体ストレスに関する研究
      我々は、血管内皮障害性因子ホモシステインで発現誘導されるタンパク質としてHerpおよびNDRG1を発見し、これらに関する研究を継続している。Herpは小胞体ストレスで強く発現誘導される小胞体膜タンパク質であり、主に小胞体関連タンパク質分解(ERAD)で機能するタンパク質として広く知られる。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などで見られる現象である。Herp、Derlin-1、Derlin-3の各遺伝子欠損マウスを作製し、それらの表現型を解析した。一方、NDRG1欠損マウスは末梢神経変性疾患Charcot-Marie-Tooth病4D型の病態を示し、NDRG4欠損マウスは局所脳虚血再灌流に脆弱性を示した。現在、Herp、Derlin群、NDRG群の機能解明に向けた研究を継続している。
    2. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
      血漿タンパク質には、血中プロテアーゼにより分解されるだけでなく、マクロファージや肝実質細胞表面上の受容体と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ分解されるものが存在する。我々は、血小板血栓形成能を抑制的に制御するVWF切断酵素ADAMTS13のクリアランス機構の解明を目指した研究を行っている。
    3. VWF産生機構に関する研究
      VWFは血管内皮細胞で合成され、血中に分泌される。その分泌には、一般に見られる分泌小胞を介した経路と、Weibel-Palade小体と呼ばれる血管内皮細胞特異的なオルガネラに一旦貯蔵された後に分泌される、二つの経路がある。我々は、生体内の血管内皮細胞に近い構造をもつように極性培養した血管内皮細胞を用いて、特にVWFの細胞内輸送に焦点をあて、その産生・分泌機構について研究を進めている。

  3. 脳循環代謝に関する研究
  4. 脳血管攣縮の成因の解明、虚血性脳卒中時に生じる虚血性ペナンブラ領域の病態解明、一過性局所脳虚血モデルの開発、虚血耐性の誘導と認知症の予防や改善効果を有する脳由来神経栄養因子BDNFの脳内産生を促進させる医療機器の開発、およびBDNF産生促進物質の探索を行っている。局所脳虚血モデルに関しては、再現性の高い治療効果の判定法として有用なラット局所脳虚血モデルを開発し(2001年)、その後、マウスモデルへと発展させた(2003年)。さらに、除外動物を設けることなく各個体の記憶学習能を定量化できる行動解析手法(水迷路変法)を開発した(2006年)。同マウスモデルは、その後の各種ノックアウト動物の神経脆弱性の判定に用い、脆弱性関連遺伝子を報告した(2011年、2012年)。さらに、脳虚血マウスを、無血操作/無血手術による脳梗塞モデルへと進化させ(2014年)、虚血負荷後の脳梗塞巣の再現性向上と致死率低下を達成した。連続的に生じさせた拡延性抑制現象が脳内BDNFを増加させ、脳梗塞体積を縮小させることの発見(1998年)をきっかけに、脳内BDNFの産生増加法の開発に着手し、特定の電位刺激が脳内のBDNF産生を促進し、脳梗塞を縮小させ(2005年)、また、記憶力を増強させることを見出した(2008年)。さらに、虚血耐性誘導時の観察において、脳皮質表面(軟膜下層)に神経幹細胞様動態を示すグリア系細胞の活性化と、その後の神経新生現象を発見した(2009年)。脳血管攣縮の成因解明に関しては、血管炎に集積するマクロファージから産生される血小板由来成長因子PDGFが遅発性の血管収縮を生じさせ、脳血管攣縮の原因と成り得ることを示した(2011年)。また、既存薬剤の脳保護作用の探索に関して、Ⅱ糖尿病薬(DPP-4阻害剤、ネシーナ)が脳内BDNFの産生を促進し、脳保護作用を示すこと(2013年)、特定電圧の生体(ヒト)への印加刺激が、緩やかな抗肥満効果を示すこと(2013年)、慢性疼痛治療剤ERV(ノイロトロピン)が脳梗塞耐性を誘導し、記憶学習能を向上させること(2015年)、適切な高電位治療がマウス脳内のBDNFを増加させるとともに、neuronal calcium sensor-1 (NCS-1)の発現およびCaMKII-αのリン酸化を増強させること(2017年)を報告した。

2016年の主な研究成果

  1. 止血および血栓形成に関する研究

    1. 血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の研究
      TTPは血漿ADAMTS13活性の著減が要因となる。我々はADAMTS13の合成ペプチド基質としてVWF73を開発し、これを用いる活性測定法を国内および海外企業へ技術移転した。今年度現在においてもADAMTS13活性検査の世界的スタンダードになっている。昨年度以前に引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、国内外で未報告の変異を複数同定するとともに、診断に対するサポートを行った。また、厚労科研費研究班のメンバーとして、TTP診療ガイド2017の作成に寄与した。
    2. 非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)の研究
      aHUSの主な発症原因は補体経路の過剰活性化をもたらす遺伝子異常であるため、診断には補体関連因子の遺伝子解析が重要となる。aHUSの遺伝子解析では補体関連因子を含む複数の遺伝子(C3、CFH、CFHR5、CFI、CFB、MCP、THBD、DGKEなど)をダイレクト・シーケンシング法で調べるが、変異が見つからずに原因不明と結論づけられる症例が約4割にのぼる。その理由の一つとして、ダイレクト・シーケンシング法で検出できないタイプの組み換え異常がCFH/CFHR遺伝子群に生じやすいことが挙げられる。そこで、デジタルPCRを利用して、このタイプの異常を従来法よりも簡便に検出できる検査法を開発した。
    3. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因の研究
      日本人の静脈血栓塞栓症の遺伝的要因として、プロテインS-K196E変異がある。約55人に1人の頻度で見られる重要な変異であるが、血漿プロテインS活性平均値は保有者と非保有者で大きくオーバーラップしており、活性値で変異の有無を判別できない。そこで我々は、変異型のみに反応する上述モノクローナル抗体を利用し、遺伝子解析を行わずに血液を調べることで変異の有無を判別できる検査法を確立した(特許出願済)。現在、知的資産部および国内企業と協同して、実用化を図っている。
    4. 血小板凝集機構の研究
      血小板凝集機構を解明することは、動脈閉塞症等を理解し、その予防法や治療法を開発するために重要である。我々は発現クローニングの手法を用いて血小板凝集反応にかかわる因子の単離同定を進め、血小板インテグリンの活性化を制御するILKを同定し、詳細な分子機構を2013年に報告した。以後も本研究を発展的に継続させており、今年度は、ILK結合タンパク質の一つであるキンドリンの研究を進めると共に、大阪大学輸血部と協同で血小板機能異常症例の解析を行った。
    5. 後天性von Willebrand症候群(AVWS)の研究
      血中の超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大・堀内久徳教授および奈良医大・松本雅則教授と協同で、VWFマルチマー解析法を標準化した。基本的にはSDSアガロース電気泳動を利用する従来法に合わせながら、実施施設や実施者が異なっても結果を比較できるように、マルチマーインデックスという指標を取り入れ、より客観的かつ定量的に分析できるように工夫した。また、当センター人工臓器部と協同で、補助人工心臓の種類によってVWFマルチマーの状態に差が生じることを詳細に検討した。

  2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究
    1. 小胞体ストレスに関する研究
      局所脳虚血障害に対して脆弱性を示すHerp欠損マウスおよびNDRG4欠損マウスを利用しながら、Herpが関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解(ERAD)と、NDRG4が関与する神経細胞機能の研究を継続している。今年度、HerpおよびDerlin-3の心筋保護効果を調べるため、心臓生理機能部との共同研究として、心臓に負荷がかかる慢性低酸素実験を実施した。野生型マウスが適応可能な酸素濃度の飼育条件において、HerpあるいはDerlin-3の完全欠損マウスでは死亡個体が現れたため、心臓や肺の組織標本を作製し、脆弱性の原因について解析を進めた。
    2. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
      ADAMTS13のクリアランスに関与する可能性のある細胞膜表面のタンパク質受容体LRP1およびSIGLEC-5のヒト全長タンパク質をHEK293細胞上に発現させ、ADAMTS13の取り込みを観察したが、いずれも取り込みは観察されなかった。また、培養細胞で分泌発現させた受容体の可溶性細胞外領域とADAMTS13の免疫沈降実験を行ったが相互作用は確認できなかった。ごく最近、マクロファージ上に発現するCD163がADAMTS13のクリアランスに関与していると報告されたため、CD163発現HEK293細胞でのADAMTS13の取り込み実験を開始した。
    3. VWF産生機構に関する研究
      ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECをフィブロネクチン上で高密度に培養することで、単層敷石状細胞を調製した。この細胞では、適正に配置されたVE-Cadherin、ZO-1、およびPECAM-1が細胞間結合を形成していたことから、生体内の血管内皮細胞に近い構造を有する細胞が調製できたと考えた。Weibel-Palade小体には、VWFだけでなく、他の細胞種においてエンドソームに含まれる分子が含まれていることから、Weibel-Palade小体の形成や維持にエンドソームが関わることを予想した。単層内皮細胞を用いてVWFの細胞内局在を調べたところ、Weibel-Palade小体の一部に後期エンドソームの分子が含まれていた。すなわち、エンドソーム因子がWeibel-Palade小体の成熟化あるいは形態維持に寄与することが示唆された。

  3. 脳循環代謝に関する研究
  4. 選択的高電位を一定期間、生体へ印加することで、脳内のBrain-derived neurotrophic factor(BDNF)を増加させることは、すでに確認していた。そのような生体反応を用いて、電気工学的に変化をもたらした様々な電位刺激を用いて、正常マウスの記憶力を向上させるか否かを、マウスを用いて観察した。1日5時間、3週間にわたり、マウスのケージに選択的高電位を負荷することで、生体への印加刺激を行った。その後、モリスの水迷路試験変法を実施し、記憶力へ及ぼす影響を解析した。その結果、一定の周波数を有する電位刺激群において、有意な脳皮質内BDNFが生じることが明らかとなった。また、同群では、空間認知記憶能において、正常マウスより有意に優れた能力を有していることが明らかとなった。当実験で用いた電位刺激は、すでに人での医療機器として認可を得ている機械の修正によって実施することができ、本実験にて優れた機能性を示すことが明らかとなった周波数を用いた電位刺激(治療)機は、本邦における医療機器としての認可を得ることができる基準に合致している。以上の結果は、当センター発明委員会に報告し、職務発明として企業と当センターとの共同出願を行った。

    また、すでに深部静脈血栓症、急性肺血栓塞栓症、電撃型紫斑病に対する治療剤として政府の認可を取得している臨床薬剤(ヒト血液製剤)を、独自に開発した、マウス局所脳虚血(3血管閉塞)モデルの急性期に静脈内投与することが、虚血時の脳血流には影響を与えずに、24時間後、または、7日後のマウス脳梗塞を縮小させ、脳神経脱落症状を改善させること、すなわち、同薬剤が脳保護効果を有することを明らかとした。この結果は、日本神経科学学会、および、米国神経科学学会にて報告した。

    さらに、neuronal calcium sensor-1 (NCS-1)欠損マウスを用いて、空間記憶力の変化を独自に改変した水迷路試験を用いて解析を行った結果、同欠損マウスの記憶力は、正常(ワイルド)マウスよりも劣っていることが明らかとなった。そして、同欠損マウスでは、解剖学的な神経構築は保たれているものの、脳内BDNFが低値であること、長期増幅やBDNFの増加シグナルを担うことが知られるCaMKII-αのリン酸化が抑制されていること、および、dopamineの発現が抑制されていることが明らかとなった。電子顕微鏡を用いた神経細胞構築の観察では、前シナプスに位置するdense core vesiclesが減少していたことより、NCS-1が欠損することで、脳内BDNFが低下し、前シナプス構造に負の影響を及ぼし、記憶力が低下することが明らかとなった。さらに、脳内BDNFを増加させることが明らかとなっている高電位刺激(上記)が、NCS-1とCaMKII-α量を増加させることも明らかとなった。以上、NCS-1とdopamineの発現、および、CaMKII-αのリン酸化とBDNFは、記憶力の制御を介して密接な関係にあることが示された。この研究の結果は、PLOS ONE に報告した。

研究業績

  1. Naito N, Mizuno T, Nishimura T, Kishimoto S, Takewa Y, Eura Y, Kokame K, Miyata T, Date K, Umeki A, Ando M, Ono M, Tatsumi E. Influence of a Rotational Speed Modulation System Used With an Implantable Continuous-Flow Left Ventricular Assist Device on von Willebrand Factor Dynamics. Artificial Organs. 40, 877-883, 2016.
  2. Kato H, Nakazawa Y, Kurokawa Y, Kashiwagi H, Morikawa Y, Morita D, Banno F, Honda S, Kanakura Y, Tomiyama Y. Human CalDAG-GEFI deficiency increases bleeding and delays αIIbβ3 activation. Blood. 128, 2729-2733, 2016.
  3. Miyata T, Uchida Y, Yoshida Y, Kato H, Matsumoto M, Kokame K, Fujimura Y, Nangaku M. No association between dysplasminogenemia with p.Ala620Thr mutation and atypical hemolytic uremic syndrome. International Journal of Hematology. 104, 223-227, 2016.
  4. Fan XP, Hovinga JAK, Shirotani-Ikejima H, Eura Y, Hirai H, Honda S, Kokame K, Taleghani MM, von Krogh AS, Yoshida Y, Fujimura Y, Lammle B, Miyata T. Genetic variations in complement factors in patients with congenital thrombotic thrombocytopenic purpura with renal insufficiency. International Journal of Hematology. 103, 283-291, 2016.
  5. Le TM, Hashida K, Ta HM, Takarada-Iemata M, Kokame K, Kitao Y, Hori O. Deletion of Herpud1 Enhances Heme Oxygenase-1 Expression in a Mouse Model of Parkinson's Disease. Parkinsons Disease. 2016, 6163934, 2016.
  6. Tsujii N, Shiraishi I, Kokame K, Shima M, Fujimura Y, Takahashi Y, Matsumoto M. Severe Hemolysis and Pulmonary Hypertension in a Neonate With Upshaw-Schulman Syndrome. Pediatrics. 138, e20161565, 2016.
  7. Kokame K. Subsequent Response of VWF and ADAMTS13 to Aortic Valve Replacement. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis . 23, 1141-1143, 2016.
  8. 小亀 浩市, 樋口(江浦) 由佳. 先天性TTP(血栓性血小板減少性紫斑病)の遺伝子解析. 血栓と循環. 24, 20-24, 2016.
  9. 堀内 久徳, 松本 雅則, 小亀 浩市. 循環器疾患随伴後天性フォンウィルブランド症候群の臨床的インパクト. 日本血栓止血学会誌. 27, 316-321, 2016.
  10. 前田 琢磨, 秋山 正志. HITの発症を誘導する免役複合体の構造. 日本血栓止血学会誌. 27, 678-682, 2016.
  11. 宮田 敏行, 秋山 正志, 中村 敏子. aHUS(非典型溶血性尿毒症症候群)の遺伝子解析. 血栓と循環. 24, 34-42, 2016.
  12. 秋山 正志, 小亀 浩市. 腸内細菌代謝産物TMAOは血小板の反応性亢進と血栓症リスクを増強する. 日本血栓止血学会誌. 27, 384, 2016.
  13. 樋口(江浦) 由佳, 小亀 浩市. 低出力レーザー療法は、巨核球の「活き」を良くすることで、血小板減少を副作用なく非侵襲的に治療する. 日本血栓止血学会誌. 27, 586, 2016.

最終更新日 2017年08月21日

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