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分子病態部

2015年の業績

研究活動の概要

分子病態部は四つの研究室から構成される。各研究室は協力し合い、循環器疾患の克服に向けて、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法を用いて研究を進めている。主に、止血および血栓形成に関する研究、循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究、脳循環代謝に関する研究を行っている。

  1. 止血および血栓形成に関する研究
    1. 血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)の研究
       TTPは多数の細小血管に血小板血栓が生じる難病である。フォンビルブランド因子(VWF)切断酵素ADAMTS13の活性が失われることで、超高分子量VWFマルチマーが増加し、血小板の過剰凝集につながる。我々は、ADAMTS13遺伝子解析、活性測定法開発、構造機能解析、遺伝子改変マウスの作製・解析などを行ってきた。先天性TTP患者の遺伝子解析における日本の拠点施設として、奈良医大と協同して50家系を解析した。
    2. 非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome; aHUS)の研究
       aHUSはTTPと同様に血栓性微小血管障害症(thrombotic microangiopathy; TMA)に属する疾患であり、半数以上の症例に補体系因子の遺伝子異常が見られる。我々は厚労科研費研究班を通して、aHUS患者遺伝子解析の拠点施設として機能している。最近日本でも治療薬として抗C5抗体が承認されたことにより、今後、aHUS研究の重要性が増すと予想される。
    3. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因の研究
       静脈血栓塞栓症の発症には遺伝的素因が関わっており、代表例として凝固第V因子-Leiden変異とプロトロンビン-G20210A変異が知られるが、いずれも日本人には見られない。我々は、日本人の約55人に1人の頻度で見られるプロテインS-K196E変異が静脈血栓塞栓症の遺伝的素因であることを明らかにし、変異保有者のプロテインS抗凝固活性は平均で約16%低いこと、日本人特有の変異であることなどを報告してきた。この変異を含め、日本人に見られる血栓性素因の研究を行っている。
    4. 血小板凝集機構の研究
       正常な止血反応と病的な血栓形成のいずれにおいても、血小板凝集は重要な役割を果たす。血小板表面に存在する種々の受容体のうち、インテグリンは安定な血小板血栓の形成に寄与し、その活性化およびシグナル伝達機構の解明は、抗血小板薬の開発に結びつく。我々はゲノム網羅的変異を導入する手法により、血小板のインサイドアウトシグナルに関わる因子としてILKを同定した。現在、より詳細なメカニズムの解明をめざして研究を継続している。
    5. von Willebrand病(VWD)/von Willebrand症候群(VWS)の研究
       VWFは止血反応の初期段階である血小板凝集において重要な血漿タンパク質である。巨大マルチマー構造を形成しており、そのサイズが大きいほど血小板凝集は強い。VWFの産生・放出、ADAMTS13による切断など、種々の機構でVWFの活性は調節されており、VWFの活性低下は、出血性疾患VWD/VWSの原因となる。近年、大動脈弁狭窄症や補助人工心臓装着の患者に見られる重篤な消化管出血に後天性VWSが関与すると考えられるようになってきたが、そのメカニズムは十分に分かっていない。そこで我々は、後天性VWSにおけるVWFマルチマーの動態と出血の関連性について研究を開始した。
    6. 血栓症に関わる臨床研究
       我々はビタミンK還元酵素VKORC1遺伝子多型が抗凝固薬ワルファリン投与量の個人差の約8%を説明することを報告し、さらに腎機能との関連を明らかにした。また、抗血小板薬アスピリン不応症に関する多施設前向き臨床試験(ProGEAR研究)に参画した。その後も病院と共同で、日本人のCYP2C19機能消失変異と抗血小板薬クロピドグレル服用時の血栓再発率に関する研究として、慢性期の脳梗塞患者を対象に前向き薬理遺伝学研究を行っている(Cognac研究)。さらに、急性期の脳梗塞患者を対象としたPRAISE研究も進めている。また、周産期婦人科および臨床検査部と共同で、血栓性素因に関する研究、妊娠時ヘパリン療法による抗凝固療法モニタリングに関する研究、新規経口抗凝固薬の凝固系マーカーへの影響の検討、急性期脳卒中の診断・病態解明のための血中バイオマーカ―の探索、ヘパリン起因性血小板減少症に関する研究などを進めている。
  2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究
     我々は、血管内皮障害性因子ホモシステインで発現誘導されるタンパク質としてHerpおよびNDRG1を発見し、これらに関する研究を継続している。Herpは小胞体ストレスで強く発現誘導される小胞体膜タンパク質であり、種々の解析の結果、主に小胞体関連タンパク質分解(ERAD)で機能するタンパク質として広く知られるようになった。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などで見られる現象である。Herp、Derlin-1、Derlin-3の各遺伝子欠損マウスを作製し、それらの表現型を解析した。一方、NDRG1欠損マウスは末梢神経変性疾患Charcot-Marie-Tooth病4D型の病態を示し、NDRG4欠損マウスは局所脳虚血再灌流に脆弱性を示すことを明らかにした。現在、Herp、Derlin群、NDRG群の分子機能解明に向けた研究を継続している。
  3. 脳循環代謝に関する研究
     脳血管攣縮の成因の解明、虚血性脳卒中時に生じる虚血性ペナンブラ領域の病態解明、一過性局所脳虚血モデルの開発、虚血耐性の誘導と認知症の予防や改善効果を有する脳由来神経栄養因子BDNFの脳内産生を促進させる医療機器の開発、およびBDNF産生促進物質の探索を行っている。局所脳虚血モデルに関しては、再現性の高い治療効果の判定法として有用なラット局所脳虚血モデルを開発し(2001年)、その後、マウスモデルへと発展させた(2003年)。さらに、除外動物を設けることなく各個体の記憶学習能を定量化できる行動解析手法(水迷路変法)を開発した(2006年)。同マウスモデルは、その後の各種ノックアウト動物の神経脆弱性の判定に用い、脆弱性関連遺伝子を報告した(2011年、2012年)。さらに、脳虚血マウスを、無血操作/無血手術による脳梗塞モデルへと進化させ(2014年)、虚血負荷後の脳梗塞巣の再現性向上と致死率低下を達成した。連続的に生じさせた拡延性抑制現象が脳内BDNFを増加させ、脳梗塞体積を縮小させることの発見(1998年)をきっかけに、脳内BDNFの産生増加法の開発に着手し、特定の電位刺激が脳内のBDNF産生を促進し、脳梗塞を縮小させ(2005年)、また、記憶力を増強させることを見出した(2008年)。さらに、虚血耐性誘導時の観察において、脳皮質表面(軟膜下層)に神経幹細胞様動態を示すグリア系細胞の活性化と、その後の神経新生現象を発見した(2009年)。脳血管攣縮の成因解明に関しては、血管炎に集積するマクロファージから産生される血小板由来成長因子PDGFが遅発性の血管収縮を生じさせ、脳血管攣縮の原因と成り得ることを示した(2011年)。また、既存薬剤の脳保護作用の探索に関して、Ⅱ糖尿病薬(DPP-4阻害剤、ネシーナ)が脳内BDNFの産生を促進し、脳保護作用を示すこと(2013年)、特定電圧の生体(ヒト)への印加刺激が、緩やかな抗肥満効果を示すこと(2013年)。さらに、慢性疼痛治療剤ERV(ノイロトロピン)が脳梗塞耐性を誘導し、記憶学習能を向上させることを報告した(2015年)。

2015年の主な研究成果

  1. 止血および血栓形成に関する研究
    1. 血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の研究
       TTPは血漿ADAMTS13活性の著減が要因となる。我々はADAMTS13の合成ペプチド基質としてVWF73を開発し、これを用いる活性測定法を国内および海外企業へ技術移転した。今年度現在においてもADAMTS13活性検査の世界的スタンダードになっている。昨年度以前に引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、診断に対するサポートや発症要因の解明を行った。
       我々が作製したADAMTS13欠損マウスを用いて、TTP以外の疾患に対するADAMTS13の関与を調べた。静脈血栓症を誘発する電気刺激誘発下大静脈障害を施したところ、ADAMTS13欠損マウスでは野生型に比べて動脈血栓だけでなく静脈血栓形成も亢進することが分かり、原著論文として発表した。小亀は第61回国際血栓止血学会学術標準化委員会のVWF部会でADAMTS13活性測定に関する講演を行い、セッションの座長も務めた。坂野は第56回日本脈管学会総会で静脈血栓症病態解析に関する講演を行った。
    2. 非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)の研究
       日本人aHUS患者の遺伝子解析を行い、患者1名にDGKE遺伝子のスプライス部位変異c.1213-2A>Gとフレームシフト変異c.71del (p.L24Cfs*145) による複合ヘテロ接合性異常症を同定した。DGKE遺伝子の異常を保有するaHUS患者には抗補体薬は効かないといわれているが、本患者は抗補体薬投与により腹膜透析からの離脱、血小板数の増加、C3値の上昇、LDH値の低下が観察され、症状の改善が見られた。本研究は奈良医大・藤村吉博名誉教授、広島県立病院・大田敏之主任部長との共同研究である。
    3. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因の研究
       ADAMTS13やプロテインSなど様々な血栓症関連タンパク質を動物細胞分泌発現系で発現精製し、解析を進めている。ADAMTS13の活性発現に必須のN末端領域(アミノ酸残基番号76-685)の大量発現精製系を確立した。そこで、静脈血栓症モデルにおいて病態悪化を示すADAMTS13欠損マウスに対し、組換えADAMTS13を投与することで病態が改善することを明らかにした。またプロテインSの野生型とK196E変異型のEGF様ドメイン領域を発現精製し、K196E変異型のみに結合する特異的モノクローナル抗体を得ることに成功した。
       日本人の静脈血栓塞栓症の遺伝的要因として、プロテインS-K196E変異がある。約55人に1人の頻度で見られる重要な変異であるが、血漿プロテインS活性平均値は保有者と非保有者で大きくオーバーラップしており、活性値で変異の有無を判別できない。そこで我々は、変異型のみに反応する上述モノクローナル抗体を利用し、遺伝子解析を行わずに血液を調べることで変異の有無を判別できる検査法を確立した。特許出願を行い、臨床応用化を図っている。
    4. 血小板凝集機構の研究
       血小板凝集機構を解明することは、動脈閉塞症等を理解し、その予防法や治療法を開発するために重要である。我々は発現クローニングの手法を用いて血小板凝集反応にかかわる因子の単離同定を進め、血小板インテグリンの活性化を制御するILKを同定し、詳細な分子機構を2013年に報告した。以後も本研究を発展的に継続させており、今年度は、ILKに結合し、血小板凝集に必須の因子であるキンドリンの研究を進めた。
    5. VWD/VWSの研究
       血中の超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大・堀内久徳教授および奈良医大・松本雅則教授と協同で、VWFマルチマー解析法を標準化した。基本的にはSDSアガロース電気泳動を利用する従来法に合わせながら、実施施設や実施者が異なっても結果を比較できるように、マルチマーインデックスという指標を取り入れ、より客観的かつ定量的に分析できるようにした。また、当センター人工臓器部と協同で、補助人工心臓の種類によってVWFマルチマーの状態に差が生じることを見出した。
    6. 血栓症に関わる臨床研究
       ProGEAR研究として、安定期の循環器疾患患者では、残存血小板凝集能やトロンボキサン誘導体量はイベント再発と関連しないことを明らかにした。原著論文として投稿し、現在リバイス中である。Cognac研究として、クロピドグレル投与を受けている安定期の脳梗塞患者では、CYP2C19遺伝子多型は残存血小板凝集能などに影響を与えるものの、イベント再発に影響しないことを明らかにした。現在、原著論文の投稿を準備中である。クロピドグレル投与を受ける急性期の脳梗塞患者を対象とするPRAISE研究では、患者登録と遺伝子検査を終えた。本研究は、脳神経内科・長束一行部長、山上宏医長、輸血管理室・宮田茂樹医長との共同で進めている。
  2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究
     局所脳虚血障害に対して脆弱性を示すHerp欠損マウスおよびNDRG4欠損マウスを利用しながら、Herpが関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解(ERAD)と、NDRG4が関与する神経細胞機能の研究を継続している。今年度、HerpおよびDerlin-3の心筋保護効果を調べるため、心臓に負荷がかかる慢性低酸素実験を実施した。心臓生理機能部との共同研究である。野生型マウスが適応可能な酸素濃度の飼育条件において、HerpあるいはDerlin-3の完全欠損マウスでは死亡個体が現れた。
     NDRG4の分子機能解明のため、NDRG4結合タンパク質の探索を試み、ナトリウム/カリウムATPaseの同定に成功した。そこで、NDRG4との結合様式の解析や機能調節の解析等を行っている。今年度は、生化学部の協力のもと、当研究所に設置されている種々の解析機器を積極的に活用し、神経細胞における機能的関与の解明を試み、NDRG4やナトリウム/カリウムATPaseに関連する新たな因子を見出した。現在論文投稿準備中である。
  3. 脳循環代謝に関する研究
     選択的高電位を一定期間、生体へ印加することで、脳内のBrain-derived neurotrophic factorを増加させることは、すでに確認していた。そのような生体反応を用いて、精神身体的ストレス後に生じるうつ症状を改善させるか否かを、マウスを用いて観察した。1日5時間、3週間にわたり、マウスのケージに選択的高電位を負荷することで、生体への印加刺激を行った。その後、強制水テスト性の精神身体ストレスを負荷し、翌日のマウスの行動様式を解析した。その結果、脳皮質内BDNFを増加させる条件にて印加させた群において、うつ症状の発現が有意に緩和された。一方、海馬内BDNFを増加させる条件を用いた群では、うつ症状の発現抑制が観られなかった。すなわち、うつ症状の緩和に、脳内BDNF量,特に、皮質内BDNF量が関与することが示され、また、安全な選択的高電位刺激が、有効な皮質内BDNF増加機器、うつ耐性誘導機器、として使用できる可能性が示唆された。当実験で用いた電位の強度は、すでに人での医療機器として認可を得ている。以上は、米国神経科学学会にて報告した。また、慢性疼痛治療剤としてすでに用いられている臨床薬剤を一定期間投与することで、マウス脳内のBDNF産生量が増加し、正常マウスの記憶力(spatial learning and memory)を向上させることはすでに報告したが、さらに、一過性局所脳虚血後に生じる脳梗塞の進展を抑制することに関する、至適用量を見出した。その結果、記憶力増強と脳梗塞耐性とのおける、それぞれの至適用量は異なっていた。以上の結果は、米国神経科学学会、および、オランダの医学誌、ブレインリサーチにて報告した。急性期意識障害における覚醒機構障害の病態解明に関して、頭部外傷後に必発する神経/グリア細胞の一過性脱分極現象である拡延性抑制、または、拡延性脱分極(spreading depolarization)が、一過性にすべての脳活動(全周波数帯における脳波)を抑制する(平坦化させる)こと、そして、そのことが、急性期の覚醒(意識)障害を惹起する可能性があることを見出している。

研究業績

  1. Banno F, Kita T, Fernandez JA, Yanamoto H, Tashima Y, Kokame K, Griffin JH, Miyata T. Exacerbated venous thromboembolism in mice carrying a protein S K196E mutation. Blood. 126, 2247-2253, 2015.
  2. Imamura H, Konomoto T, Tanaka E, Hisano S, Yoshida Y, Fujimura Y, Miyata T, Nunoi H. Familial C3 glomerulonephritis associated with mutations in the gene for complement factor B. Nephrology Dialysis Transplantation. 30, 862-864, 2015.
  3. Maruyama K, Akiyama M, Kokame K, Sekiya A, Morishita E, Miyata T. ELISA-Based Detection System for Protein S K196E Mutation, a Genetic Risk Factor for Venous Thromboembolism. PLOS ONE. 10, , 2015.
  4. Mitsuguro M, Okamoto A, Shironouchi Y, Sano M, Miyata S, Neki R, Araki T, Hamamoto T, Yoshimatsu J, Miyata T. Effects of factor VIII levels on the APTT and anti-Xa activity under a therapeutic dose of heparin. International Journal of Hematology. 101, 119-125, 2015.
  5. Nakajo Y, Yang D, Takahashi JC, Zhao Q, Kataoka H, Yanamoto H. ERV enhances spatial learning and prevents the development of infarcts, accompanied by upregulated BDNF in the cortex. Brain Research. 1610, 110-123, 2015.
  6. Oh YM, Park HB, Shin JH, Lee JE, Park HY, Kho DH, Lee JS, Choi H, Okuda T, Kokame K, Miyata T, Kim IH, Lee SH, Schwartz RH, Choi K. Ndrg1 is a T-cell clonal anergy factor negatively regulated by CD28 costimulation and interleukin-2. Nature Communications. 6, , 2015.
  7. Ohta T, Urayama K, Tada Y, Furue T, Imai S, Matsubara K, Ono H, Sakano T, Jinno K, Yoshida Y, Miyata T, Fujimura Y. Eculizumab in the treatment of atypical hemolytic uremic syndrome in an infant leads to cessation of peritoneal dialysis and improvement of severe hypertension. Pediatric Nephrology. 30, 603-608, 2015.
  8. Sekiya A, Morishita E, Maruyama K, Torishima H, Ohtake S. Fluvastatin Upregulates the Expression of Tissue Factor Pathway Inhibitor in Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 22, 660-668, 2015.
  9. Yoshida Y, Miyata T, Matsumoto M, Shirotani-Ikejima H, Uchida Y, Ohyama Y, Kokubo T, Fujimura Y. A Novel Quantitative Hemolytic Assay Coupled with Restriction Fragment Length Polymorphisms Analysis Enabled Early Diagnosis of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome and Identified Unique Predisposing Mutations in Japan. PLOS ONE. 10, , 2015.
  10. Tashima Y, Banno F, Akiyama M, Miyata T. Influence of ADAMTS13 deficiency on venous thrombosis in mice. Thrombosis and Haemostasis. 114, 206-207, 2015.
  11. Hisano M, Ashida A, Nakano E, Suehiro M, Yoshida Y, Matsumoto M, Miyata T, Fujimura Y, Hattori M. Autoimmune-type atypical hemolytic uremic syndrome treated with eculizumab as first-line therapy. Pediatrics International. 57, 313-317, 2015.
  12. Miyata T, Uchida Y, Ohta T, Urayama K, Yoshida Y, Fujimura Y. Atypical haemolytic uremic syndrome in a Japanese patient with DGKE genetic mutations. Thrombosis and Haemostasis. 114, 862-863, 2015.
  13. Miyata T. GWA study for ADAMTS13 activity. Blood. 125, 3833-3834, 2015.
  14. Kawase Ishihara K, Kokubo Y, Yokota C, Hida E, Miyata T, Toyoda K, Matsumoto M, Minematsu K, Miyamoto Y. Effect of plasma fibrinogen, high sensitive C reactive protein, and cigarette smoking on carotid atherosclerosis: The Suita Study. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24, 2385-2389, 2015.
  15. Fujimura Y, Kokame K, Yagi H, Isonishi A, Matsumoto M, Miyata T. Hereditary deficiency of ADAMTS13 activity: Upshaw-Schulman syndrome. ADAMTS13 - Biology and Disease. , 73-90, 2015.
  16. Higashi M, Hirano K, Kobayashi K, Ikeda Y, Issiki A, Otsuka T, Suzuki A, Yamaguchi S, Zaima N, Hamada S, Hanada H, Suzuki C, Nakamura H, Nagasaka H, Miyata T, Miyamoto Y, Kobayashi K, Naito H, Toda T. Distinct cardiac phenotype between two homozygotes born in a village with accumulation of a genetic deficiency of adipose triglyceride lipase. International Journal of Cardiology. 192, 30-32, 2015.
  17. 小亀 浩市. ADAMTS13. 新・血栓止血血管学「血管と血小板」. , 197-203, 2015.
  18. 丸山 慶子, 宮田 敏行. 日本人の血栓性素因. 止血・血栓ハンドブック. , 24-29, 2015.
  19. 樋口(江浦) 由佳, 小亀 浩市. フィブリン線維を架橋することで強固なフィブリン塊を形成して止血を誘導する合成ポリマー. 日本血栓止血学会誌. 26, 483-483, 2015.
  20. 丸山 慶子, 小亀 浩市. ヘモグロビンはGP1bαを介して血小板の活性化とアポトーシスを誘導する. 日本血栓止血学会誌. 26, 692-692, 2015.
  21. 小亀 浩市. 血栓性血小板減少性紫斑病. 血液フロンティア. 25, 51-57, 2015.
  22. 宮田 敏行, 瀬谷 司. 疾患から見た補体の活性化と制御. 血液フロンティア. 25, 23-32, 2015.
  23. 宮田 敏行. 血栓症をめぐる将来展望、基礎(凝固)の立場から. INTERNATIONAL REVIEW OF THROMBOSIS. 10, 62-65, 2015.
  24. 宮田 敏行. 民族特異的血栓性遺伝子変異の研究. 日本血栓止血学会誌. 26, 687-691, 2015.
  25. 坂野 史明. 血栓症のモデルマウス. 血液フロンティア. 25, 73-79, 2015.

最終更新日 2016年11月08日

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