血液は、流動性を維持しながら全身を循環し、出血時には即座に凝固して失血を防ぐという、相反する機能を巧みに調節している。この血流維持と止血のバランスを適切に制御するため、血液や血管には多様な調節機構が備わっている。しかし、流動性を維持する機能が低下したり、凝固反応が過剰に進行したりすると血栓性疾患を引き起こし、逆に凝固機能が低下すると出血性疾患につながる。当部では、血栓症や出血症に関わる物質や現象の謎を解明し、診断・治療・予防に貢献することを目指している。そのため、血漿タンパク質、血小板、血管内皮細胞などを研究対象とし、分子レベルから個体レベルに至るまで、多角的なアプローチで研究を進めている。

【血小板が主役となる止血・血栓形成に関する研究】
　止血反応の初期には、血小板の血管壁への粘着と、その後の血小板凝集が起こる。この過程の調節には、血漿タンパク質von Willebrand因子 (VWF) と、その切断酵素ADAMTS13が重要な役割を果たす。VWFが不足するとvon Willebrand病などの出血性疾患を引き起こし、逆にADAMTS13が不足すると血栓性血小板減少性紫斑病などの血栓性疾患を発症する。当部では、患者の遺伝子解析、タンパク質の構造・機能解析、細胞機能解析、遺伝子改変マウスを用いた解析を通じて、VWF–ADAMTS13系が関与する生命現象の解明に取り組んでいる。また、得られた知見を基に、臨床医学への直接的な貢献を目指している。

【凝固因子が主役となる血栓形成に関する研究】
　血液が迅速に凝固できるよう、血漿には多くの凝固タンパク質が存在し、これらは連鎖的かつ爆発的な速度で活性化してフィブリン網を形成する。しかし、この凝固反応が本来起こるべきでない場所で生じると、心筋梗塞や脳梗塞などの重篤な疾患の原因となる。そのため血液には凝固反応を制御する仕組みが備わっており、その代表例がアンチトロンビン、プロテインC、プロテインSである。これらの機能が低下すると、静脈血栓塞栓症のリスクが高まる。当部では、遺伝子解析、タンパク質の構造・機能解析、細胞機能解析、遺伝子改変マウスを用いた解析を通じて、凝固制御の精緻なメカニズムの解明を目指している。また、得られた知見を基に、新たな診断法の開発にも取り組んでいる。

【細胞機能に関する研究】
　血液凝固と抗凝固のバランスを維持する上で、血管内皮細胞の役割は極めて重要である。血管内皮細胞が機能障害を起こすと、特定の因子の発現が誘導される。その一つとして、我々が発見したHerpは、小胞体ストレスに鋭敏に応答する膜タンパク質である。小胞体ストレスは、虚血、動脈硬化、糖尿病などの循環器疾患においても観察される現象であり、HerpはDerlin群とともに、小胞体関連タンパク質分解 (ERAD) の主要な構成因子として機能する。当部では、ERADの生理的意義の解明を目指し、その分子メカニズムの研究を進めている。
　また、白血球は免疫系の中心的役割を担い、異物排除や感染防御に関与する多様な細胞群から構成される。その中でも好中球や好酸球などの顆粒球は、細胞死を介して炎症反応を制御し、血栓形成にも関与する。好酸球は感染防御やアレルギー応答に関与する白血球の一種であり、その細胞死過程は免疫機能に重要な影響を与える。我々は、好酸球のプログラム細胞死 (EETosis) において、細胞外に放出される顆粒が時間経過とともに特異的な自家蛍光を示すことを発見した。現在、好中球の細胞死 (NETosis) との比較を通じて、EETosisが血栓形成に及ぼす影響を解析している。

血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) に関する研究
　先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を継続的に行い、国内外で未報告の病原性変異を複数同定するとともに、診断支援を実施した。特に、ある患者ではADAMTS13遺伝子全長に及ぶ大規模欠失の可能性が示唆されため、サンガー法およびNanopore技術を用いたロングリードシーケンシング解析を進めたところ、全長欠失が強く示唆される所見を得た。デジタルPCRによるブレイクポイント探索を開始したところ、ADAMTS13遺伝子周辺領域において、正常 (コピー数2) でも欠失 (コピー数1) でもない想定外の中間的な値 (コピー数1.2–1.8) が得られた。原因究明のため全ゲノム解析を進めた結果、ADAMTS13遺伝子を含む染色体9長腕の約8 Mb領域にヘテロ接合性喪失 (loss of heterozygosity; LOH) を同定した。患者試料量が限られていたため解析はここで完了せざるを得なかったが、得られた全データを矛盾なく説明し得る仮説は以下のとおりである：生殖細胞の段階で、染色体9の相同染色体の一方に8Mbにわたる欠失が生じた。これは細胞生存に致死的であったため、もう一方の相同染色体を鋳型とした組換え修復が起こり (その結果としてLOHが生じた)、さらにその組換え過程で繰り返し配列間のミスアニーリングにより複数パターンの欠失が生じた (デジタルPCRで中間的なコピー数が得られた要因) というものである。現在、これらの解析結果を取りまとめた論文を作成中である。
　また、先天性TTPのように責任遺伝子が明確な遺伝性疾患の解析に適したPCRベースのロングリードシーケンシング法について、ドライ解析手法の検証と新規ソフトウェア開発を進めた。既存ソフトウェアには誤った解析結果が含まれ得ることがあり、これを克服するため、アレル間の不均衡増幅やキメラ生成などPCR特有の現象に対処可能な、PCR産物に特化したフェージング解析ソフトウェアを開発した。開発は、病態ゲノム医学部と共同で進めた。その結果、様々なPCR産物に対応可能なソフトウェアの開発に成功した。先天性TTP患者のデータ解析に適用したところ、高精度な解析結果が得られることを実証した。この新規ソフトウェアの開発に関する論文をJxivで公開し、専門誌に投稿した。

von Willebrand因子 (VWF) に関する研究
　von Willebrand病 (VWD) における病原性変異の同定は、確定診断・病型分類・病態解明に重要である。しかし、VWF遺伝子は巨大で、偽遺伝子や反復配列を含むため、サンガー法やショートリード次世代シーケンシングでは解析が困難である。その結果、遺伝子解析が実施されない、あるいは実施しても結論に至らない症例が少なくない。これらの課題を克服するため、ロングリードシーケンシングを用いたVWF遺伝子解析法の構築に取り組んだ。ロングリード法は、従来法に比べて構造異常や反復配列の解析に優れる。そこで、先天性TTP患者解析で培った技術と経験を活かし、PCRベースのロングリードシーケンシング法をVWF遺伝子に適用した。あわせて方法論を取りまとめた論文を国際誌に投稿し、受理された。今後、本手法が臨床診断の精度向上に貢献することが期待される。
　VWFの分子機能を詳細に解析するため、2種類のタグ (HA、V5) を付加したVWF (VWF-HA、VWF-V5) をそれぞれ発現するノックインマウス2系統を作製した。VWFは血管内皮細胞および巨核球／血小板で発現することが知られているが、発現細胞の違いによる分子機能の差異については、これまで十分に検討されていない。そこで、産生細胞の異なるVWFを識別可能な解析系を構築できる利点を活かし、発現細胞ごとの機能的差異の解析を進めた。血小板由来VWFに固有の機能を探るため、血小板活性化実験等を実施した。さらに、血小板による免疫調節機能の一つであるマクロファージ活性化の調節について、その作用機序を明らかにするため、血小板がマクロファージへ及ぼす作用を細胞レベルで解析する系の構築を進めた。

静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
　血液凝固制御因子の活性低下は、静脈血栓塞栓症などの発症要因となるため、その発現調節機構の理解は極めて重要である。我々はこれまで、血液凝固制御因子の一つであるプロテインS (PS) の遺伝子発現が、イントロン1によって複雑に制御される可能性を、培養細胞およびマウスを用いた解析により示してきた。今年度は、これまでの研究成果を取りまとめ、国際誌に投稿した。また、PROS1遺伝子のイントロン１内に存在する96塩基がORFの一部として挿入された新規PSバリアント (PS-long) をコードするmRNAが、ヒト肝臓組織に存在することを見出した。PS-longの含有率は組織により異なり、肝臓で約10%、肺で5%、心臓で約1%であった。これまで、PROS1遺伝子における新規スプライシングバリアントや選択的スプライシングの制御機構に関する報告は存在しない。今年度はさらに、ExonTrapベクターを用いた解析を行い、PS-longのスプライシングを制御する配列を同定した。
　PSおよびプロテインC (PC) 欠損症は先天性血栓性素因であり、そのスクリーニング検査として抗原量および活性の測定が重要である。現在のPSおよびPC活性測定法は、フィブリンやトロンビンの生成量から活性を算出する方法が主流であり、いくつか解決すべき課題を含む。そこで我々は、PSおよびPCの活性測定に適した凝固第V因子 (FV) 改変体を作製し、活性化PCおよびPSによる当該FV改変体の切断を定量することで活性を算出する、新たな測定法を構築した。現在、本測定法の実用化に向け、企業との共同研究を進めている。さらに、より高感度な測定系の構築を目指し、APC切断により新たに露出する領域に対する抗体の作製に成功し、特許出願を行った。本抗体は、当該分野の基礎研究においても有用なツールとなることが期待される。

好酸球EETosisに関する研究
　好酸球は、寄生虫・細菌に対する感染防御や、アレルギー性疾患における免疫応答に関与している。我々は、PMAやLPSなどの刺激により誘導される好酸球のプログラム細胞死 (EETosis) の過程で、細胞外に放出される好酸球由来の細胞内顆粒が、時間経過とともに特異的な自家蛍光を示すことを見出した。この自家蛍光は生細胞・固定細胞の双方で観察され、自家蛍光シグナル強度を測定することで、好酸球を単離することなく、化合物による濃度依存的なEETosis抑制作用を定量的に評価できる。我々は、好中球の細胞死 (NETosis) を抑制することが報告されていた２種のバニロイド化合物が、単離好酸球培養および混合白血球培養においてEETosisを阻害することを見出し、その阻害効果を自家蛍光により定量化した。現在、これらの成果を取りまとめた論文を投稿中である。令和7年度は、自家蛍光によるEETosis定量系をハイスループットスクリーニング系へ展開し、化合物スクリーニングを開始した。本系では、白血球やPMAを含む培地および固定液の384ウェルプレートへの分注をロボットシステムで自動化している。さらに、Operetta CLSハイコンテントアナリシスシステムを用いることで、1ウェル当たり複数枚の共焦点自家蛍光画像および明視野画像の取得、自家蛍光を示す細胞数のカウント、自家蛍光強度の測定、ならびに各ウェルの自家蛍光強度解析までを自動化している。現在、EETosisの制御機構の解明とEETosisを制御する薬剤の探索を目的として、FDA承認薬物ライブラリーを用いたEETosis阻害薬のスクリーニングを進行中である。