血液は流動性を保って全身の血管内を循環し、出血時には即座に固まって失血を防ぐ。血流維持と止血という相反する機能をバランス良く制御するために、血液や血管には様々な機構が備わっている。流動性を維持する機能が低下したり凝固反応が過剰に進んだりすると血栓性疾患につながり、逆向きにバランスが崩れると出血性疾患につながる。血栓症や出血症に関わる物質や現象に潜む謎を解き明かし、診断・治療・予防に貢献することが当部の目指すところである。そのために、血漿タンパク質や血小板、血管内皮細胞等を対象とし、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法で研究を進めている。

【血小板が主役となる止血・血栓形成に関する研究】
　止血反応の初期には血管壁への血小板粘着とそれに続く血小板凝集が起こり、その反応の調節にはvon Willebrand因子（VWF）と呼ばれる血漿タンパク質とVWF切断酵素ADAMTS13が重要である。VWFが不足するとvon Willebrand病などの出血性疾患になり、ADAMTS13が不足すると血栓性血小板減少性紫斑病などの血栓性疾患になる。我々は、患者の遺伝子解析、タンパク質構造機能解析、細胞機能解析、遺伝子改変マウス解析などを通じ、VWF–ADAMTS13が関与する生命現象の探求に取り組むとともに、臨床医学への直接的な貢献に努めている。

【凝固因子が主役となる血栓形成に関する研究】
　血液を迅速に凝固させるために血漿には多くの凝固タンパク質が存在し、それらは爆発的なスピードで活性化してフィブリン網を形成する。そのような反応が起こるべきでない場所で起こると、心筋梗塞や脳梗塞などの原因となる。そこで血液には、凝固反応を制御する仕組みが備わっており、その代表格であるアンチトロンビン・プロテインＣ・プロテインＳの機能低下は静脈血栓塞栓症の原因となる。我々は、遺伝子解析、タンパク質構造機能解析、細胞機能解析、遺伝子改変マウス解析などを通じ、凝固制御の精緻なメカニズムを明らかにするとともに、新たな診断法の開発に取り組んでいる。

【細胞機能に関する研究】
　血液凝固と抗凝固のバランスを保つ上で、血管内皮細胞の果たす役割は大きい。血管内皮細胞の機能障害で発現誘導される因子として我々が発見したHerpは、小胞体ストレスに鋭敏に応答する膜タンパク質である。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などの循環器疾患でも見られる現象であり、HerpはDerlin群とともに主に小胞体関連タンパク質分解（ERAD）で働く。我々はERADの生理的意義の解明に向けた研究を進めている。

血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に関する研究
　これまでに引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、国内外で未報告のバリアントを複数同定するとともに、診断に対するサポートを行った。また、厚労科研費研究班のメンバーとして、TTP診療ガイドの改定に取り組み、TTP診療ガイド2023を作成した。さらに、従来法で原因バリアントを同定できていない症例に対し、Nanoporeを用いたロングリードシーケンシング法による解析を進めた。今年度は、ロングレンジPCRの再デザインを行い、互いに約5 kbずつ重なる約15 kb長のPCR産物でADAMTS13遺伝子全長をカバーすることで、解析に適するデータを安定的に得ることに成功した。候補バリアントの抽出に向けて種々のソフトウェアを試行錯誤しながら選定し、その解析結果をサンガー法により検証し、１塩基バリアントの高い正確性を確認した。また、新たにリリースされたフローセルR10.4.1を用いた解析にも取り組み、塩基配列決定のさらなる正確性向上を確認した。候補バリアントの解析ソフトウェアとして使用していたMedakaは開発終了（使用不可）となったため、新規ソフトウェアClair3の解析環境を構築した。

後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
　AVWSの病態解析に必要となる超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大学および奈良県立医科大学と協同し、VWFマルチマー解析法を標準化し、その方法を用いた臨床検体の解析を進めている。大動脈弁狭窄症および左室補助循環装置（LVAD）装着患者を解析対象とし、定血漿量における解析と定抗原量における解析を進め、約1300検体の解析を完了した。これらのデータをまとめた原著論文を国際誌に投稿した（審査中）。

血管内皮細胞Weibel-Palade小体（WPB）に関する研究
　WPBはゴルジ体で形成された後、細胞辺縁部に輸送され成熟する。我々は血管内皮細胞において、プロトンポンプV-ATPaseがWPBに局在することを見出し、その意義の解明を目指している。V-ATPaseは多数のサブユニットから構成されるタンパク質複合体である。これまでの研究により、V0aサブユニットのアイソフォームのうちV0a1とV0a2は異なる集団のWPBに局在することと、V0a1をノックダウンするとWPBはゴルジ体から分離できないことを明らかにした。V-ATPaseは主要なpH制御分子の一つであるが、WPBの内腔pHが形成過程で変化するか不明である。そこで今年度は、WPB内腔pHの動的変化をイメージング解析した。WPB内腔pHは、膜貫通ドメインを除いたP-selectin（luminal P-sel）にpH感受性GFPを付加した組換えタンパク質を培養血管内皮細胞に発現させて測定した。その結果、WPB内腔pHはWPB形成過程初期に徐々に酸性化することがわかった。現在、論文執筆中である。

静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
　血液凝固制御因子の活性低下は静脈血栓塞栓症等の原因となるため、その発現調節機構の理解は重要である。我々は、血液凝固制御因子の一つであるプロテインＳの遺伝子発現がイントロン１によって複雑に調節される可能性を見出した。そこで、培養細胞を用いた実験により発現調節機構の解析を進め、関与するシス配列を絞り込んだ。

血小板Siglec-5/14リガンド候補の同定とその生理機能に関する研究
　我々は、ADAMTS13がSiglec-5発現細胞およびSiglec-14発現細胞にエンドサイトーシスで取り込まれること、その取り込みがシアル酸非依存的であること、Siglec-5/14のV-setドメインが必須であることを明らかにし、今年度、Thrombosis Research誌に原著論文として発表した。続いて、好中球表面に高発現するSiglec-5/14に結合するリガンドを、血小板の受容体や分泌タンパク質から同定する研究を開始した。これまでにTHP-1などの白血球細胞株を用いて同定された様々なSiglecリガンドのデータをもとに、血小板上に発現するTLR2やTLR4を有力なリガンド候補と考え、Siglec-5/14との結合を調べた。まず、TLR2あるいはTLR4発現細胞への可溶性Siglec-14の結合を免疫染色で検出することを試みたが確認できなかったため、TLRなどの様々な受容体候補を発現する細胞あるいは血液から分離した血小板とSiglec発現細胞との結合をフローサイトメトリーで検証している。

小胞体ストレスに関する研究
　低酸素ストレスに対して脆弱性を示すHerpおよびDerlin-3欠損マウスを利用し、HerpおよびDerlin-3が関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解（ERAD）の研究を進めている。Herp欠損マウスおよびDerlin-3欠損マウスは心臓の収縮異常を示し、Derlin-3欠損マウスは血中脂質レベル異常と血中免疫グロブリンG（IgG）量低下を示した。Derlin-3ヘテロ欠損同士の交配で得た同腹仔（野生型、ヘテロ欠損、ホモ欠損）から回収した血清IgG量を解析したところ、野生型に比べてヘテロ欠損およびホモ欠損でIgG量は低下していた。昨年度は、解析個体数の確保のためにC57BL/6系統のDerlin-3欠損マウスにICR系統を交配したF2世代の同腹仔を用い、解析可能な産仔数は２倍以上に増加したものの、この遺伝背景では通常飼育下でのIgG量低下が見られないことが分かった。そこで今年度は抗原刺激による影響を検討したが、通常飼育下と同様に個体差が大きく、ICR系統とのF2世代での解析は困難であることが分かったため、対策を検討中である。