循環器疾患の克服に向けて、部員が協力し合い、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法を用いて研究を進めている。テーマは主に、A. 止血および血栓形成に関する研究、B. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究、C. 脂質異常症の病態解明・治療法開発に関する研究である。

1. 止血および血栓形成に関する研究

1. 血栓性血小板減少性紫斑病に関する研究
   　血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP）は多数の細小血管に血小板血栓が生じる難病である。血漿タンパク質フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; VWF）を切断する酵素ADAMTS13の活性が失われることで、超高分子量VWFマルチマーが増加し、血小板の過剰凝集につながる。我々は、ADAMTS13遺伝子解析、活性測定法開発、構造機能解析、遺伝子改変マウス作製・解析などを行ってきた。先天性TTP患者の遺伝子解析における日本の拠点施設として、奈良県立医科大学と協同してこれまで約60家系を解析している。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   　静脈血栓塞栓症の発症には遺伝的背景が関わっている。我々は、日本人の約55人に1人の頻度で見られるプロテインS-K196E変異が静脈血栓塞栓症のリスク要因であることを明らかにし、日本人特有の変異であること、変異が影響をもたらす分子機構などを報告してきた。現在、血栓症に対する新たな診断法の開発を見据えた、血液凝固・抗凝固システムの基礎研究を進めている。
3. 後天性von Willebrand症候群に関する研究
   　VWFは止血初期段階の血小板凝集において重要な血漿タンパク質である。巨大マルチマー構造を形成し、その分子サイズが大きいほど血小板凝集能は高い。種々の機構でVWFの活性は調節されており、VWFの活性低下は出血性疾患の原因となる。近年、大動脈弁狭窄症や補助人工心臓装着の患者に見られる重篤な消化管出血に後天性von Willebrand症候群（acquired von Willebrand syndrome; AVWS）が関与すると考えられるようになってきたが、その機序は十分に分かっていない。現在、AVWSにおけるVWFマルチマーの動態と出血の関連性についての研究を行っている。



2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究

1. 小胞体ストレスに関する研究
   　我々は、血管内皮障害性因子で発現誘導されるタンパク質としてHerp等を発見し、これらに関する研究を継続している。Herpは小胞体ストレスで強く発現誘導される小胞体膜タンパク質であり、主に小胞体関連分解(endoplasmic reticulum-associated degradation; ERAD)で機能する。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などで見られる現象である。Herp、Derlin-1、Derlin-3の各欠損マウスを作製し、それらの表現型を解析した。現在、HerpおよびDerlin群の機能解明に向けた研究を継続している。
2. 血管内皮細胞Weibel-Palade小体に関する研究
   　VWFは血小板による止血反応を担う中心的な分子であり、血液中の機能的VWFが減少するとvon Willebrand病（VWD）やAVWSと呼ばれる出血症を引き起こす。血管内皮細胞で合成されたVWFは、Weibel-Palade小体（WPB）と呼ばれる血管内皮細胞特有のオルガネラに貯蔵され、適時に血中へ分泌される。WPBは分泌小胞の一種であると考えられるが、その形成機構はほとんど不明である。我々は血管内皮細胞のWPBにプロトンポンプVacuolar H⁺-ATPase（V-ATPase）が局在することを見出した。現在、WPBの形成におけるV-ATPaseの役割を解明する目的で研究を進めている。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   　血漿タンパク質には、血中プロテアーゼによる分解で代謝されるタイプだけでなく、単球・マクロファージや好中球、肝実質細胞表面上の受容体と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることで代謝されるタイプが存在する。我々は、ADAMTS13およびVWFのクリアランス機構の解明を目指した研究を行い、両者共通の受容体候補として、SIGLEC5とSIGLEC14を同定した。ヒト好中球では、SIGLEC5/14が高発現している。現在我々は、ADAMTS13/VWFのクリアランス機構に加え、ADAMTS13/VWFとSIGLEC5/14の結合が好中球に特徴的な細胞死Netosisに影響することを予想して研究を進めている。
4. 血液凝固とリン脂質輸送分子に関する研究
   　血液凝固反応は、血液凝固因子群が逐次的に活性化することで引き起こされる。その活性化反応は液相中でも進行するが、細胞膜の主要成分であるリン脂質が存在することで爆発的に加速する。すなわち、迅速な血液凝固は細胞膜表面を反応の場とするが、特定のリン脂質が必要な部位に局在化する仕組みについては、ほとんど分かっていない。最近の研究で、細胞膜外層のリン脂質の分布はスクランブラーゼやフリッパーゼと呼ばれる分子群によって制御されることが明らかになってきた。我々は、これら分子群の血液凝固反応への寄与を明らかにする目的で研究を進めている。
5. プロテインSによる血液脳関門保護作用に関する研究
   　プロテインSは抗凝固作用以外に、構造的ホモログGAS6とともにTAM受容体（TYRO3、AXL、MERTK）へ結合し、様々な生理機能を調節する。マウスにおいてプロテインSは、TYRO3およびスフィンゴシン-1-リン酸受容体依存的に、血液脳関門（blood-brain barrier; BBB）を虚血・低酸素による破壊から保護する。また、MERTKはBBBの完全性維持に関与しており、神経侵襲性ウイルスの感染を防止する機能があると報告されている。しかし、PS/GAS6-TAM軸を介したBBB機能調節の分子機構は不明な点が多い。我々は昨年度、虚血・低酸素だけでなく高グルコース血症によって引き起こされるBBB損傷に対してもプロテインSが保護作用を示すことを見出したので、現在、プロテインSによるBBB保護作用との関係について研究を進めている。



3. 脂質異常症の病態解明・治療法開発に関する研究

1. 家族性高コレステロール血症のガイドライン作成に関する研究
   　動脈硬化性疾患予防ガイドライン2022に家族性高コレステロール血症（FH）の項目を作成するために、成人および小児の診断基準および診療指針について検討している。また、遺伝子解析によって確定診断されている当センターと金沢大学のFH患者群について、診断基準最適化を行っている。
2. 家族性高コレステロール血症の遺伝子解析に関する研究
   　当センターのFH患者1500例について、既に遺伝子解析を行い、臨床診断に役立てるとともに、その病態への関与を明らかにしてきた。今年度は、日本のFH遺伝子解析2大センターの症例を統合し、遺伝子変異のリストを報告した。また、日本人初となるアポリポプロテインB遺伝子変異によるFH例を報告した。さらに、当センター心臓内科との共同研究で、ダブルヘテロ変異を有する患者の生涯リスクを明らかにし、遺伝子解析による予後予測を可能にした。
3. 家族性高コレステロール血症ホモ接合体の国際治験
   　FHホモ接合体に対して、新しい薬剤の開発が行われる中、当センターにおいては日本の中核として国際治験に参加し、成果を挙げている。Alirocumab、Evinacumabの国際治験に参加し、FHホモ接合体に対する有効性および安全性、耐用性、薬物動態についての報告を行った。
4. 原発性高脂血症調査研究
   　厚生労働省難治性疾患政策研究事業「原発性高脂血症に関する調査研究」に携わり、脂質異常症難病である家族性高コレステロール血症ホモ接合体、シトステロール血症、原発性高カイロミクロン血症、タンジール病、無βリポタンパク血症、脳腱黄色腫症、LCAT欠損症全疾患のレジストリーを開始、それぞれの英文総説を作成した。脂質異常症難病の小児成人移行期医療の課題については、対策を提示した。
5. 新規架橋型人工核酸搭載アンチセンス医薬の開発apoC-III
   　我々は、これまで脂質異常症難病を対象として、アンチセンスを用いた新しい治療薬の開発を行ってきた。ヒトアポC3に対するアンチセンスについては、バックアップ配列を含め、特許出願を行った。本研究はAMED「橋渡し研究戦略的推進プログラム・シーズB」に採択され、非臨床および臨床試験における用法・用量を検討することを目的とした非ヒト霊長類の試験について、昨年に設立された当センター発ベンチャーであるリードファーマ株式会社と共同で進めている。

1. 止血および血栓形成に関する研究

1. 血栓性血小板減少性紫斑病に関する研究
   　これまでに引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、国内外で未報告の変異を複数同定するとともに、診断に対するサポートを行った。また、厚労科研費研究班のメンバーとして、TTP診療ガイド2017の改訂版（2020版）を完成した。さらに、従来法で原因変異が同定できていない患者家系に対し、Nanoporeを用いたロングリードシーケンシング法による解析を開始した。まず、解析系の確立のため、従来法で1782bpの欠失を同定した家系に対して実施した。ADAMTS13遺伝子全長約45kbpの領域を、一部重複領域をもつ6個のPCR産物（5-10 kb）でカバーするためにPCR条件等の最適化を試み、至適条件を見つけた。そのPCR産物でライブラリーを調製し、ロングリードシーケンシングを実施したところ、期待通り1782bpの欠失を同定することができた。今後、未解決の試料に対して本方法を実施する。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   　静脈血栓塞栓症の遺伝的要因として、プロテインS-K196E変異がある。日本人によく見られるリスク変異であり、その有無を知ることは血栓症予防の点で重要である。我々は、遺伝子解析を行わずに変異の有無を判別できる検査法を確立したので（特許出願済）、知的資産部および国内企業と協同して、臨床検査現場での実用化を視野に入れた共同研究を進めた。これと平行して、静脈血栓塞栓症の原因となる遺伝子変異の探索を進めている。また、血栓形成傾向を調べるための新たな検査法の開発を進めるため、その原理を検討している。
3. 後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
   　AVWSの病態解析に必要となる超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大学および奈良県立医科大学と協同し、VWFマルチマー解析法を標準化し、その方法を用いた臨床検体の解析を進めている。大動脈弁狭窄症および左室補助循環装置（LVAD）装着患者が解析対象である。定血漿量解析は完了し、現在、定抗原量解析を進めている。定血漿量および定抗原量での解析結果と臨床データを照合し、その有用性を比較する予定である。また、VWFマルチマー解析を進める中で、VWFマルチマーの特性と分子機能をさらに明らかにし、AVWSの病態との関連を深く理解することを目的として、VWFマルチマーを構成するバンドの生化学的解析を実施した。その過程で、世界で最も良く使われているVWF抗体が、Fibronectinに強く交差することに気付いた。Fibronectinは血漿に含まれるタンパク質であり、VWFとほぼ同じ分子量を持つため、ウエスタンブロット解析においてVWFとFibronectinとの見分けが付かず、分子量情報が無いELISAや組織染色では、さらに見分けることは困難である。我々は、精製Fibronectinで交差成分を吸着することでFibronectin由来シグナルを除去できることを見出した。本VWF抗体が使用された論文を調べたところ、Fibronectinの交差が含まれたまま扱われているデータが散見されたため、この交差性について、広く周知する予定である。

2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究

1. 小胞体ストレスに関する研究
   　低酸素ストレスに対して脆弱性を示すHerpおよびDerlin-3欠損マウスを利用し、HerpおよびDerlin-3が関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解（ERAD）の研究を継続している。心エコーやMRI等による心機能評価を行った結果、Herp欠損マウスおよびDerlin-3欠損マウスにおいて心臓の収縮異常による機能低下を明らかにした。一方、HerpおよびDerlin-3欠損マウスのストレス脆弱性を幅広く解析したところ、Derlin-3欠損マウスにおいて、血中脂質レベル異常および血中免疫グロブリンG（IgG）量低下を見出した。今年度は、血中IgG量の低下について、詳細な解析を実施した。Derlin-3ヘテロ欠損同士の掛け合わせで得られた同腹仔（野生型、ヘテロ欠損、ホモ欠損）から血清を回収し、含まれるIgG量を解析したところ、野生型に比べて、ヘテロ欠損およびホモ欠損でIgG量は低下していた。また、IgG量の低下がB細胞の分化異常（抗体産生細胞である形質細胞の減少等）に起因する可能性について、Flowcytometryを用いた解析を開始した。
2. 血管内皮細胞Weibel-Palade小体に関する研究
   　小胞体でモノマーとして合成されたVWFは、ゴルジ体でマルチマーに変換され、血管内皮細胞Weibel-Palade小体（WPB）に貯蔵される。VWFは分子サイズが大きいほど止血能は高い。すなわち、マルチマー化はVWFの止血タンパク質としての機能発現に重要なプロセスである。我々はヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECにおいて、プロトンポンプV-ATPaseがWPBに局在していることを見出し、研究を進めている。V-ATPaseは多数のサブユニットから構成される複合体である。我々は、aサブユニットはアイソフォームによって異なるWPB集団に局在することを見出した。これらのサブユニットを枯渇してもVWFのマルチマー化には大きな影響は見られなかったが、WPBの形成能に影響があることが判明した。現在、詳細なメカニズムを解析している。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   　VWFは、ADAMTS13と同様、SIGLEC5発現細胞およびSIGLEC14発現細胞にエンドサイトーシスによって取り込まれることを見出した。SIGLEC5/14によるVWFの取り込みはシアル酸非依存的であった。VWFはSIGLEC9発現細胞にも取り込まれた。SIGLEC5は細胞内領域のITIMモチーフおよびITIM-likeモチーフ内のチロシン残基リン酸化を介して免疫機能を抑制する。これらのモチーフに変異を導入してVWFの取り込みに対する影響を調べたところ、ADAMTS13と同様、ITIM-likeモチーフ内のY544F変異はVWFの取り込みにほとんど影響しなかった。ITIMモチーフ内のY520F変異は細胞内に取り込まれたADAMTS13量を著しく増大させたが、VWFの取り込みにはほとんど影響しなかった。SIGLEC5/14の細胞外ドメインをSIGLEC3の相同ドメインと置換した変異体発現細胞でのADAMTS13/VWFの取り込みを調べた結果、N末端側領域のV-setドメインがADAMTS13およびVWF両方の取り込みに必須であることが分かった。ヒト好中球は病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular patterns; PAMPs）等の刺激により活性化されると、Netosisと呼ばれる特徴的な細胞死が誘導され、核内DNAを放出し病原体等をトラップするネット様構造Neutrophil Extracellular Traps (NETs)を形成する。好中球はヒト組織でSIGLEC5/14を最も高発現していることから、in vitroでNETs形成へのADAMTS13の作用を調べたところ、ADAMTS13はNETs形成を促進することが分かった。現在この作用へのSIGLEC5/14の関与を検討している。
4. 血液凝固とリン脂質輸送分子に関する研究
   　ビタミンK依存性血液凝固因子のN末端には、Glaドメインとよばれる領域が存在する。これらの血液凝固因子はGlaドメインを介して細胞表面の酸性リン脂質と結合し、細胞表面で血液凝固反応を進行させる。一方、フォスファチジルセリンなどの酸性リン脂質は、細胞膜の内層に限局している。したがって、血液凝固反応を進行させるためには、細胞膜内層から外層への酸性リン脂質の輸送が必要である。TMEM16ファミリーおよびP4-ATPaseファミリーの因子の一部はリン脂質輸送分子（スクランブラーゼとフリッパーゼ）であると報告されていることから、我々はこれらが血液凝固反応に寄与する可能性について研究を行っている。まず、各分子の発現コンストラクトを株化培養細胞に導入し、解析に必要な細胞集団を得た。さらに酸性リン脂質の輸送能評価系、細胞膜外層に存在する酸性リン脂質量の検出系、および血液凝固因子の活性化能評価系を確立した。現在、これらの系を用いて調製したリン脂質輸送分子発現細胞の評価を行っている。
5. プロテインSによる血液脳関門保護作用に関する研究
   　血液脳関門（BBB）は、糖尿病など高グルコース血症をもたらす疾患で損傷すると報告されている。高グルコースによるBBB損傷に対するプロテインSの保護作用を調べるために、高グルコースが内皮細胞の細胞間接着に及ぼす影響を調べた。BBBの研究で汎用されるマウス脳血管内皮細胞株b.End3を高グルコース条件下で培養すると、通常グルコース濃度での培養に比べて、タイトジャンクションのマーカーであるZO-1の分布が断続的になるとともに、ZO-1局在部位での発現レベルが減少した。さらに、高グルコース培養は細胞内アクチン繊維の分布の整列度も下げた。これらの結果から、高グルコース培養はb.End3細胞の細胞間接着能を減弱させることが示唆された。高グルコース培養時に組換えプロテインS（EGFドメインからSHBGドメインまでの領域）を加えたところ、ZO-1の分布・発現レベルおよびアクチン繊維の配向は、通常グルコース濃度で培養された細胞に類似することが分かった。これらの結果は、プロテインSは高グルコースによる細胞間接着異常から細胞を保護する機能があることを示唆する。b.End3細胞はMertkを高発現しており、内在性のプロテインSおよびTyro3の発現も確認された。

3. 脂質異常症の病態解明・治療法開発に関する研究

1. 家族性高コレステロール血症(FH)のガイドライン作成に関する研究
   　動脈硬化性疾患予防ガイドライン2022の家族性高コレステロール血症の項目を作成するために、成人家族性高コレステロール血症ガイドライン検討委員会、および小児家族性高コレステロール血症ガイドライン検討委員会が立ち上がり、斯波が委員長、松木が事務局を務めている。それぞれの診断基準および診療指針について検討を重ね、全体の骨格が出来上がっている。また、当センターと金沢大学の、遺伝子解析にて確定診断を下されているFH患者群について、診断基準最適化のプロジェクトを遂行中である(Tada, Hori, Matsuki, Harada-Shiba 投稿準備中)。
2. 家族性高コレステロール血症(FH)の遺伝子解析に関する研究
   　当センターのFH患者1500例について、既に遺伝子解析を行い、臨床診断に役立てるとともに、その病態への関わりを明らかにしてきた。本年度は、日本のFH遺伝子解析の2大センターである、当センターと金沢大学の症例を統合し、LDL受容体遺伝子変異のリストを報告した(Tada, Hori, Harada-Shiba, J Clin Lipidol, 2020)。また、日本人初の、アポリポプロテインB遺伝子変異によるFH例を報告した(Hori, Harada-Shiba J Clin Lipidol, 2020)。また、当センター心臓内科との共同研究で、遺伝子診断された 269名のFH患者において、LDLR・PCSK9遺伝子のダブルヘテロ変異を有する患者の生涯リスクを明らかにし、LDLR、PCSK9単独の変異を有する例に比べ、生涯リスクが極めて高いことを明らかにした(Doi, Hori, Harada-Shiba, JAHA in press)。これらの成果より、日本人FHの病態を明らかにし、遺伝子解析による予後予測を可能にした。
3. 家族性高コレステロール血症(FH)ホモ接合体の国際治験
   　FHホモ接合体に対して、新しい薬剤の開発が行われる中、当センターにおいて、日本国内の中核として、国際治験に参加し、成果を挙げている。Alirocumabの国際治験の結果、PCSK9阻害剤であるAlirocumabがFHホモ接合体に対して、LDL-C、アポリポプロテインB、Lp(a)を有意に低下させることを報告した(Blom, Harada-Shiba et al, J Am Coll Cardiol, 2020)。また、ANGPTL3阻害薬である、Evinacumabの国際治験に参加し、FHホモ接合体に対する有効性および安全性の報告を行い(Raal, et al, N Engl J Med 2020)、日本人とcaucasianとの安全性、耐用性、薬物動態に違いがないことを報告した(Harada-Shiba et al, Atherosclerosis 2020)。
4. 原発性高脂血症調査研究
   　厚生労働省難治性疾患政策研究事業「原発性高脂血症に関する調査研究」について、斯波は研究代表者として脂質異常症難病研究に携わっている。本年度は、脂質異常症難病である家族性高コレステロール血症ホモ接合体、シトステロール血症、原発性高カイロミクロン血症、タンジール病、無βリポタンパク血症、脳腱黄色腫症、LCAT欠損症全疾患のレジストリーを開始、それぞれの英文総説を作成した。脂質異常症難病の、小児成人移行期医療の課題については、対策を提示した。
5. 新規架橋型人工核酸搭載アンチセンス医薬の開発 apoC-III
   　我々は、これまで脂質異常症難病を対象として、アンチセンスを用いた新しい治療薬の開発を行ってきた。PCSK9、アポC3を標的とした研究開発を進めてきており、既にカニクイザルを用いて薬効の確認を終えている。ヒトアポC3に対するアンチセンスについては、バックアップ配列を含め、特許許出願を行った（出願番号：特願2019-520317号、発明の名称：ApoC3を標的としたアンチセンス核酸）。また、本研究はAMED「橋渡し研究戦略的推進プログラム・シーズB」に採択され、非臨床および臨床試験における用法・用量を検討することを目的とした非ヒト霊長類の試験について、昨年に設立された当センター発ベンチャーであるリードファーマ株式会社と共同で進めている。

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