細胞間情報伝達は、生体を精巧に制御するための最も基本的なメカニズムであり、循環調節をはじめとする生体のホメオスタシスの維持に重要な役割を果している。生化学部では、細胞間情報伝達を担う生理活性物質の中でも特にペプチド性因子に着目して新規因子の探索を行い、それによる未知の情報伝達および生体制御機構の解明に取り組んでいる。新規ペプチドの同定は容易ではないが、その発見は非常に大きなインパクトを与えるだけでなく、全く異なった視点での研究展開をもたらす。実際、我々のグループによる心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(1984年)や脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)(1988年)の発見によって、それまでポンプとしてのみ機能すると考えられていた心臓が、ホルモンを分泌する内分泌器官として位置付けられた。また、脳から発見したC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)(1990年)が血管内皮細胞から分泌されるため、血管壁もペプチドホルモンを分泌する内分泌組織として捉えられた。一方で、これらの生理活性ペプチドの発見を基盤とした臨床応用研究も推進しており、その成果として、ANPとBNPは、それぞれ心不全の治療および診断薬として臨床応用されている。このように新しい生理活性物質の発見は、それまで考えも及ばなかった制御系の存在を明示すると共に、新しい診断・治療薬の開発に繋がることも期待できる。

　上記のような研究の経緯を背景として、生化学部では新規生理活性ペプチドの探索による循環調節因子の発見を優先課題としており、そのための新しい活性測定法や精製手技からなる探索法や構造解析法の開発を行っている。その結果として、グレリンの発見（1999年）やオーファン受容体GPR66（FM3）の内因性リガンドとしてのニューロメジンUの同定（2000年）、さらにニューロメジンSの発見（2005年）や新規ペプチドNeuromedin U precursor-related peptide（NURP）の発見（2017年）等に繋げた。また近年では、循環器疾患の基盤となる肥満・糖尿病およびその関連疾患の理解と制御を目的として、肥満・エネルギー代謝調節に関与する未知のペプチド性生理活性物質の探索も実施している。

　生化学部で発見したペプチドについては、遺伝子発現および分泌調節、作用機序や新たな生理機能の解明等の基礎的研究を進めると共に、当センター研究所、病院およびセンター外の研究グループと連携して、病態生理的意義の解明や新しい診断、治療薬としての臨床応用を目指した研究も進めている。

　一方、上記ペプチド性因子に関する研究のみならず、当研究グループで発見した骨形成タンパク質（BMP-3b）等についても、新たな機能解析や病態生理的意義の解明に関しての研究を進めている。

○生化学部では、新規物質を基盤として、具体的には主に以下のテーマの研究を行っている。

1. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー（ANP, BNP, CNP）の新たな機能解明
2. ニューロメジンUとニューロメジンSに関する新たな研究
3. グレリン（Ghrelin）に関する研究
4. Bone morphogenetic protein-3bの新たな機能に関する研究
5. 新しい活性検出法を用いた新規生理活性ペプチドの探索に関する研究

1. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー（ANP, BNP, CNP）に関する研究

• 3種のナトリウム利尿ペプチド（NP）のうち、ANPとBNPは心臓で産生・分泌され、主に循環ホルモンとして機能する。ANPとBNPの共通受容体であるGuanylyl cyclase-A(GC-A)は心臓にも発現しており、ANPとBNPはオートクリン・パラクリン因子としても機能している。


GC-A欠損マウス(GC-A-KO)のメスには周産期に心不全で死亡する個体が存在する。妊娠・出産・授乳を2度経験した野生型マウス（WT）・GC-A-KOの心機能評価を行ったところ、GC-A-KOでは、WTに比べ顕著な左室径拡大および左室収縮能低下を認めた。次に、妊娠・出産・授乳のいずれの過程において内因性ANP・BNPが心保護的に作用するか調べた。GC-A-KOでは授乳2週目をピークに心臓重量が有意に増加した。マイクロアレイ解析の結果、GC-A-KOにおける授乳期心肥大の病態形成に、IL-6の関与が疑われた。実際、授乳期GC-A-KOの心臓では、IL-6シグナル伝達分子であるSTAT3が活性化しており、抗マウスIL-6受容体抗体投与により、GC-A-KOにおける心肥大は改善傾向を認めた。これらの結果は、GC-A-KOが「周産期心筋症」モデル動物になり得ることを示す。


• CNPは主には血管内皮細胞等で産生・作用する血管作動性ペプチドで、循環ホルモンANP/BNPとは異なり局所因子として、CNP特異的受容体Guanylyl cyclase-Bを介して作用する。最近、炎症細胞、線維芽細胞に対する役割として抗炎症・抗線維化作用も注目されている。


慢性炎症疾患である肥満・糖尿病は、循環器疾患の基盤となる。そこでこれまで、CNPの脂肪細胞を標的とした新たな抗肥満作用や脂肪肝炎で生じる肝線維化改善作用を見出してきた。CNPのこれらの作用を発展させ、脂肪組織の中でも変形性膝関節症（膝OA）に深く関与する膝蓋下脂肪体（IFP）に注目し、そこでのCNPの作用を検討した。その結果、膝OAモデルラットへのCNPの膝関節内投与は、IFPの線維化抑制を伴う疼痛改善作用を示し、更には、軟骨損傷も低減されており、疼痛・軟骨損傷の両者を改善する新たな膝OA治療薬開発への可能性を示した。作用機序として、線維化因子TGF-βによるコラーゲン1型発現の抑制、IFP部位の軟骨基質分解酵素ADMTS-4の抑制を明らかにしているが、血管内皮障害の寄与が示唆されたため、CNPの血管保護作用に着目したメカニズム解明も進めている。
2. ニューロメジンUとニューロメジンSに関する新たな研究

• ニューロメジンU（NMU）とニューロメジンS（NMS）は、当研究室で発見した神経ペプチドであり、同一の活性部位を有するため共通の受容体(1型および2型)を介して機能する。これまでに、NMUとNMSの代表的な機能として、中枢性摂食・エネルギー代謝調節やサーカディアンリズムの形成、血圧・心拍数増加による循環調節、中枢性体温調節等を示した。中枢においてNMSとNMUは同様の作用を誘発するが、興味深いことにNMSの活性はNMUに比して約10倍強力であった。また近年では、NMU/NMS受容体の選択的アゴニストを開発するとともに、NMU前駆体タンパク質からもう一つの生理活性ペプチドとして強力なプロラクチン分泌促進活性を持つNMU precursor-related peptideが産生されることを明らかにした。


NMUとNMSは、活性に必須な7アミノ酸残基からなる同一のC末端構造を有するため、この構造を修飾することにより、NMU/NMS受容体1型及び2型への選択的アゴニストを開発してきた。一方、NMU/NMSは、中枢で2型受容体を介してエネルギー代謝を亢進して体重を減少させることから、このシステムは肥満症の治療標的として注目されている。そこで、2型受容体選択的アゴニストであるCPN-116について投与ルートと治療薬としての可能性を検討した。その結果、CPN-116は中分子量であり、血清中よりも脳脊髄液中でより安定であったことから、CPN-116を経鼻投与したところ、脳脊髄液中での濃度が上昇するとともに、投与量依存的な体重減少を確認した。この結果は、CPN-116の肥満症治療薬としての可能性を示すとともに、NMU受容体2型受容体を介したプロラクチン分泌抑制活性による高プロラクチン血症の治療薬としての可能性を示すものであった。
3. グレリン（Ghrelin）に関する研究

• グレリンは、主に胃底腺のX/A like cellから分泌され、胃から分泌されたグレリンによる摂食シグナルは、胃周辺の迷走神経末端から、迷走神経節および孤束核に到達し、孤束核から視床下部へはノルアドレナリン神経系を介して視床下部に伝達されることを明らかにした。また、グレリン投与は、急性心筋梗塞モデルラットの交感神経活動を抑制して急性期死亡を減少させるため、虚血性心疾患におけるグレリンの有用性が示された。


グレリンは、他の生理活性ペプチドにみられない3番目のセリン残基のアシル化修飾がその活性に必須であるが、その理由は未だ明らかになっていない。そこで、アンタゴニストの結合したグレリン受容体GHS-Rの結晶構造を、久留米および京都大学との共同研究で解析した。この結果、GHS-Rのリガンド結合ポケットは、E124とR283による塩橋によって分岐しており、最も特徴的な構造として、フェニルアラニン残基のクラスターを含む疎水性アミノ酸残基が豊富なTM6バンドルとTM7バンドルの間に広いギャップ構造であるクレバスが存在した。変異体解析により、グレリンのアシル基とギャップ構造間の相互作用が、GHS-Rを活性なコンフォメーションに変換することに寄与している可能性が示された。また、幾つかのアミノ酸残基がGHS-Rのリガンド非依存的な恒常的活性化に関与していることも示された。

• グレリンや受容体の構造と分子進化、また活性とそれらの関連を明らかにするため、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等の非哺乳脊椎動物を材料に研究を進めている。これまで、軟骨魚類や真骨魚類、両生類が哺乳類にはないユニークな構造をもつこと、またグレリンが哺乳類のみならず非哺乳脊椎動物でも下垂体から成長ホルモン分泌促進、あるいは摂食、消化管運動を調節すること等、グレリンの分子進化や構造、活性について特異かつ重要な知見を得ている。


魚類のウナギにおいて、血漿グレリンあるいは胃でのグレリン遺伝子発現量が絶食状態で増加すること、またグレリンは無尾両生類のネッタイツメガエルで胃および上部消化管の収縮運動に有効であるが、ウシガエルやトノサマガエルでは無効であること、さらに鳥類のキジにおいてグレリンとモチリンの構造を決定し、消化管収縮にはグレリンは無効で、同じキジ目のニワトリとは制御機構が異なることを示した。
4. Bone morphogenetic protein-3bの新たな機能に関する研究

• Bone morphogenetic protein-3b (BMP-3b)は、我々が骨組織より1996年に同定したタンパク質である。BMP-3bは、構造上BMPファミリーに属するが、他のBMPファミリーとは異なる独自の作用を有している。例えば、Smad2/3系を介した骨形成抑制作用や脂肪細胞分化抑制作用等である。BMP-3bは、循環調節に重要な部位に存在しており、これら組織における新たな機能解明を目指した研究を推進している。


最近の研究にて、BMP-3bが脂肪細胞由来の新たなアディポサイトカインとして脂肪細胞分化抑制作用を示すことや、BMP-3bを脂肪組織に過剰発現するマウスがエネルギー消費亢進作用や抗肥満作用を示すことを見出した。一方、BMP-3b KOマウスにおいては、骨格筋の萎縮作用や加齢によるBMP-3bの発現変動から、加齢性サルコペニアに着目してその関連性を調べた。その結果、骨格筋では間葉系前駆細胞（SM-IMP）特異的にBMP-3bが発現し、また、ヒトの骨格筋においては加齢により発現量が顕著に低下していた。培養細胞系で、BMP-3bは筋細胞面積の増加やシュワン細胞の分化形質の安定化作用を示す一方、老齢マウスへの投与では筋量・筋力の向上が見られることから、SM-IMP由来のBMP-3bが筋組織の維持作用を有し、その減少が加齢性サルコペニア病態の一因となることが明らかになった。更に、SM-IMPは、サルコペニア病態における骨格筋の脂肪化の元となる細胞であり、BMP-3bのSM-IMP脂肪分化抑制を作用機序とするサルコペニア改善作用が示唆された。
5. 新しい活性検出法の構築と新規生理活性ペプチドの探索に関する研究

• 生理活性ペプチドは、それぞれ特異的な受容体を介して細胞に情報を伝達しており、受容体の多くはGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。従前より、リガンドが不明なため機能が知られてないGPCR遺伝子（オーファンGPCR）は数多く存在し、内因性リガンド探索による新規ペプチドの同定が期待されている。これまでに、生化学部ではこの手法を用いて、グレリンやニューロメジンU、ニューロメジンSを単離・同定している。現在でも新たな活性検出法を導入し、未知のペプチド探索を進めている。


これまで構築した活性検出系を駆使することで、オーファンGPCRの内因性リガンド探索を行い、2019年度、一つのオーファンGPCR発現細胞に対し、特異的な細胞内Ca²⁺上昇活性の検出に成功した。2020年度は、本活性物質について、活性を指標にイオン交換、逆相HPLCを組み合わせて精製を行い、単離・構造決定に成功した。機能解析した結果、本物質は標的オーファンGPCRのリガンドではなく、使用した細胞株に内在する受容体に結合し、その細胞内シグナルが標的オーファンGPCRを介してCa²⁺シグナルに変換されたことを明らかにした。

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