循環器疾患の克服に向けて、部員が協力し合い、分子レベルから個体レベルまで幅広い手法を用いて研究を進めている。テーマは主に、A. 止血および血栓形成に関する研究、B. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究、C. 脳循環代謝に関する研究である。

1. 止血および血栓形成に関する研究

1. 血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に関する研究
   　血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP）は多数の細小血管に血小板血栓が生じる難病である。血漿タンパク質フォンビルブランド因子（von Willebrand factor; VWF）を切断する酵素ADAMTS13の活性が失われることで、超高分子量VWFマルチマーが増加し、血小板の過剰凝集につながる。
   我々は、ADAMTS13遺伝子解析、活性測定法開発、構造機能解析、遺伝子改変マウス作製・解析などを行ってきた。先天性TTP患者の遺伝子解析における日本の拠点施設として、奈良県立医科大学と協同してこれまで約60家系を解析している。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   　静脈血栓塞栓症の発症には遺伝的背景が関わっている。我々は、日本人の約55人に1人の頻度で見られるプロテインS-K196E変異が静脈血栓塞栓症のリスク要因であることを明らかにし、日本人特有の変異であること、変異が影響をもたらす分子機構などを報告してきた。この変異を含め、血栓性素因の研究を行っている。
3. 後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
   　VWFは止血初期段階の血小板凝集において重要な血漿タンパク質である。巨大マルチマー構造を形成し、そのサイズが大きいほど血小板凝集能は高い。種々の機構でVWFの活性は調節されており、VWFの活性低下は出血性疾患の原因となる。近年、大動脈弁狭窄症や補助人工心臓装着の患者に見られる重篤な消化管出血に後天性von Willebrand症候群（acquired von Willebrand syndrome; AVWS）が関与すると考えられるようになってきたが、その機序は十分に分かっていない。現在、AVWSにおけるVWFマルチマーの動態と出血の関連性についての研究を行っている。



2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究

1. 小胞体ストレスに関する研究
   　我々は、血管内皮障害性因子で発現誘導されるタンパク質としてHerp等を発見し、これらに関する研究を継続している。Herpは小胞体ストレスで強く発現誘導される小胞体膜タンパク質であり、主に小胞体関連分解（endoplasmic reticulum-associated degradation; ERAD）で機能する。小胞体ストレスは虚血や動脈硬化、糖尿病などで見られる現象である。Herp、Derlin-1、Derlin-3の各欠損マウスを作製し、それらの表現型を解析した。現在、HerpおよびDerlin群の機能解明に向けた研究を継続している。
2. VWFの細胞内輸送に関する研究
   　VWFは、血管内皮細胞特有のオルガネラWeibel-Palade小体にマルチマー分子として貯蔵され、適時に血液中へ分泌される。VWFの分泌異常はvon Willebrand症候群と呼ばれる出血症を引き起こすが、VWFの合成から分泌に至るまでのメカニズムには依然として不明な点が多い。我々はVWFの成熟化および細胞内輸送に焦点をあて、その分子機構について研究を行っている。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   　血漿タンパク質には、血中プロテアーゼによる分解で代謝されるタイプだけでなく、マクロファージや肝実質細胞表面上の受容体と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることで代謝されるタイプが存在する。我々は、VWF切断酵素ADAMTS13のクリアランス機構の解明を目指した研究を行い、クリアランス受容体候補として、SIGLEC5とSIGLEC14を同定した。現在、その詳細な解析を進めている。
4. 肝星細胞における血漿タンパク質発現調節機構の研究
   　血液凝固因子の増加と凝固制御因子の減少は血栓症のリスクに、その逆は出血症のリスクになり得る。VWFを切断することで血小板血栓形成を抑制的に調節するADAMTS13は、肝星細胞で特異的に合成されるが、その発現調節機構は不明である。我々はホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXがADAMTS13のmRNA量を増加させることを見出したので、その転写調節機構を調べている。
5. 血液凝固とリン脂質輸送分子に関する研究
   　血液凝固反応は、血液凝固因子群が逐次的に活性化することで引き起こされる。その活性化反応は液相中でも進行するが、細胞膜の主要成分であるリン脂質が存在することで、爆発的に加速する。すなわち迅速な血液凝固は細胞膜表面をその反応の場として必要とするが、必要なリン脂質が必要な部位にどのようにもたらされるのかについて、ほとんど研究されてこなかった。我々は血液凝固反応制御の視点から、リン脂質輸送メカニズムについて研究を行っている。
6. プロテインSによる血液脳関門保護作用に関する研究
   　プロテインS（PS）は抗凝固作用以外に、TAM受容体（TYRO3、AXL、MERTK）を介して様々な生理機能を調節することが明らかになってきた。マウスにおいてPSは、TYRO3およびスフィンゴシン-1-リン酸受容体依存的に、血液脳関門（blood-brain barrier; BBB）を虚血・低酸素による破壊から保護すると報告されているが、その詳細な分子機構は不明である。そこで今年度、PSによるBBB保護作用機構の解明を目指す研究を開始した。



3. 脳循環代謝に関する研究

　我々は、脳血管攣縮の成因の解明、虚血性脳卒中時に生じる虚血性ペナンブラ領域の病態解明、一過性局所脳虚血モデルの開発、虚血耐性の誘導と認知症の予防や改善効果を有する脳由来神経栄養因子BDNFの脳内産生を促進させる医療機器の開発、およびBDNF産生促進物質の探索を行ってきた。独自開発した局所脳虚血モデルでは、再現性の高いラット局所脳虚血モデルを開発し（2001年）、その後、マウスモデルへと発展させた（2003年）。行動解析に関しては、各個体の記憶学習能を定量化できる独自の改良を加えた水迷路変法を開発した（2006年）。マウス脳虚血モデルは、その後の各種ノックアウト動物の神経脆弱性の判定に用い、脆弱性関連遺伝子を報告した（2011年、2012年）。脳虚血マウスは、無血外科操作にまで進化し（2014年）、虚血負荷後の脳梗塞巣の再現性向上と致死率の極限までの低下に成功した。

　また、特定の電圧レベル帯を有する電位刺激が脳内BDNF産生を促進し、それが脳梗塞を縮小させ（2005年）、記憶力を増強させることを見出した（2008年）。虚血耐性誘導時の観察において、脳皮質表面（軟膜下層）に神経幹細胞様動態を示すグリア系細胞の活性化と神経新生現象を発見した（2009年）。脳血管攣縮の成因解明に関しては、血管炎に集積するマクロファージから産生される血小板由来成長因子PDGFが遅発性の脳血管攣縮の原因と成り得ることを示した（2011年）。

　一方、既存薬剤の脳保護作用の探索に関して、II型糖尿病薬（DPP-4阻害剤、ネシーナ）が脳内BDNFの産生を促進して脳保護作用を示し（2013年）、特定電圧の生体への印加刺激が抗肥満効果を示すこと（2013年）、慢性疼痛治療剤ERV（イロトロピン）が脳梗塞耐性を誘導して記憶学習能を向上させ（2015年）、適切な高電位治療がマウス脳内BDNFを増加させるとともにNCS-1の発現とCaMKII-αのリン酸化を増強すること（2017年）、活性化プロテインCが脳保護作用を示し、低用量側に至適用量が存在することを発見した（2017-8年）。

　画像診断医学部および脳外科との共同研究により、小動物専用7T-MRIを用いてマウス脳梗塞モデルを解析し、虚血/再灌流開始より不可逆的壊死巣（脳梗塞巣）の検出に資する超早期脳梗塞診断原理を開発し、同成果の論文報告を行った（2019）。

1. 止血および血栓形成に関する研究

1. 血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に関する研究
   　これまでに引き続き、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子解析を行い、国内外で未報告の変異を複数同定するとともに、診断に対するサポートを行った。また、厚労科研費研究班のメンバーとして、TTP診療ガイド2017の改訂版作成を開始した。
2. 静脈血栓塞栓症および血栓性素因に関する研究
   　静脈血栓塞栓症の遺伝的要因として、プロテインS-K196E変異がある。日本人によく見られるリスク変異であり、その有無を知ることは血栓症予防の点で重要である。我々は、遺伝子解析を行わずに変異の有無を判別できる検査法を確立したので（特許出願済）、知的資産部および国内企業と協同して、臨床検査現場での実用化を視野に入れた共同研究を進めた。これと平行して、静脈血栓塞栓症の原因となる遺伝子変異の探索を進めている。また、血栓形成傾向を調べるための新たな検査法の開発に着手した。
3. 後天性von Willebrand症候群（AVWS）に関する研究
   　AVWSの病態解析に必要となる超高分子量タンパク質VWFマルチマーの動態を正確に分析することを目的として、東北大学および奈良県立医科大学と協同し、VWFマルチマー解析法を標準化し、その方法を用いた臨床検体の解析を進めている。大動脈弁狭窄症および左室補助循環装置（LVAD）装着患者が解析対象である。定血漿量解析は完了し、現在、定抗原量解析を進めている。定血漿量および定抗原量での解析結果と臨床データを照合し、その有用性を比較する予定である。また、VWFマルチマー解析を進める中で、VWFマルチマーの特性と分子機能をさらに明らかにし、AVWSの病態との関連を深く理解することを目的として、VWFマルチマーを構成するバンドの生化学的解析も開始した。

2. 循環器疾患に関連する細胞機能に関する研究

1. 小胞体ストレスに関する研究
   　低酸素ストレスに対して脆弱性を示すHerpおよびDerlin-3欠損マウスを利用し、HerpおよびDerlin-3が関与する小胞体ストレス応答および小胞体関連タンパク質分解（ERAD）の研究を継続している。心エコーやMRI等による心機能評価を行った結果、Herp欠損マウスおよびDerlin-3欠損マウスにおいて心臓の収縮異常による機能低下を明らかにした。
   一方、HerpおよびDerlin-3欠損マウスのストレス脆弱性を幅広く解析したところ、Derlin-3欠損マウスにおいて、血中脂質レベル異常を見出した。これらの異常の発症機序を調べるため、各臓器からタンパク質やRNAを抽出し、関与が示唆される代謝経路やシグナル伝達経路の解析を進めたところ、線維芽細胞増殖因子FGFファミリーに属するFGF21が関与する可能性を見出した。
   現在、Derlin-3とFGF21の関連について、血中FGF21濃度や、FGF21の下流の経路などの解析を進めている。
2. VWFの細胞内輸送に関する研究
   　VWFは血管内皮細胞で合成され、Weibel-Palade小体（WPB）と呼ばれる単膜のオルガネラにマルチマーとして貯蔵される。小胞体で合成されたVWFダイマーは、さらにゴルジ体でジスルフィド結合により架橋され、巨大マルチマーに成熟する。VWFマルチマーは、WPB内部にVWF tubuleと呼ばれる準結晶性の管状構造体として高密度に貯蔵される。VWFのマルチマー化およびtubule化には酸性環境が必要であることがin vitro再構成実験で示されているが、そのような微小環境が細胞内において形成される仕組みは不明である。我々はヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECにおいて、プロトンポンプVacuolar H⁺-ATPase（V-ATPase）がWPBに局在していることを見出し、研究を進めている。これまでの成果により、ゴルジ体近傍にもV-ATPaseが存在し、その活性がVWFのマルチマー化に寄与する可能性が考えられた。そこでV-ATPaseを構成するサブユニットに蛍光タンパク質タグを導入し、その細胞内局在を調べた。その結果、サブユニット構成の異なる2種類のV-ATPaseがWPBに局在することが判明した。
3. 血漿タンパク質のクリアランスに関する研究
   　ADAMTS13のクリアランス受容体としてCD163が報告されていたが、我々は細胞膜上のシアル酸受容体として同定されたヒトSIGLEC5およびSIGLEC14を発現させた細胞が高効率にADAMTS13を取り込むことを見出した。SIGLEC5/14においてArg119はADAMTS13の取り込みに関与しなかったため、その取り込みはシアル酸非依存的であると考えられた。SIGLEC5は細胞内領域のITIM、ITIM-likeモチーフ内のチロシン残基リン酸化を介して免疫機能を抑制する。ITIM-likeモチーフ内のY544F変異はMDTCSの取り込みに影響しなかった。一方、ITIMモチーフ内のY520F変異は細胞内MDTCS量を著しく増大させた。一方、SIGLEC14は膜内のArg362を介してITAM含有アダプタータンパク質DAP12と結合し、免疫系を活性化する。DAP12との結合を阻害するR362A変異はMDTCSの取り込みに影響せず、取り込みにはDAP12との結合は必要でないと示唆された。
4. 肝星細胞におけるADAMTS13発現調節機構の研究
   　ADAMTS13は生体において主として肝星細胞で産生され血中に分泌されるが、その発現調節機構はほとんど分かっていない。我々はヒト肝星細胞株であるLX-2にホスホジエステラーゼ（PDE）阻害剤3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）を投与すると、ADAMTS13の発現量が3倍以上増加することを見出した。そこで様々なcAMPシグナル伝達経路分子の阻害剤（PKA阻害剤H89、PKG阻害剤KT5823、PKB阻害剤MK2206、CNG阻害剤LCD、EPAC阻害剤ESI-09）を用いてADAMTS13の発現への影響を調べたが顕著な影響は見られなかった。ADAMTS13のプロモーター領域のレポーターアッセイにおいて、-1203～+444（転写開始点を+1とする）の領域は転写活性を示したが、IBMXの培地への添加は転写活性に影響しなかった。現在さらに上流側のプロモーター領域の解析を進めている。
5. 血液凝固とリン脂質輸送分子に関する研究
   　ビタミンK依存性血液凝固因子のN末端には、Glaドメインとよばれる領域が存在する。これらの血液凝固因子はGlaドメインを介して細胞表面の酸性リン脂質と結合し、細胞表面で血液凝固反応を進行させる。一方、フォスファチジルセリンなどの酸性リン脂質は、細胞膜の内側に限局している。したがって、血液凝固反応を進行させるためには、細胞膜内側から表面へ酸性リン脂質を輸送することが必要である。TMEM16ファミリーおよびP4-ATPaseファミリーの因子の一部はリン脂質輸送分子であると報告されている。我々は、これらが血液凝固反応に関与する可能性について研究を行っている。まず、各因子発現コンストラクトを各種培養細胞に導入し、その発現系の最適化を行った。現在、酸性リン脂質の細胞膜表面露出を検出する系の確立を進めている。
6. プロテインSによる血液脳関門保護作用に関する研究
   　血液脳関門（BBB）の研究で汎用されるヒト脳毛細血管内皮細胞株 hCMEC/D3はTAM受容体を発現している。hCMEC/D3細胞においてプロテインS（PS）の発現を調べたところ、低レベルで発現していた。そこでhCMEC/D3細胞に対するPSの効果を調べるために、組換えPSをhCMEC/D3細胞培養培地へ加えたところ、密着結合のマーカーであるZO-1の発現が誘導された。BBB機能は、高血糖や虚血再灌流時にTNFαの増加に伴って障害される。そこで現在、これらの病態を模倣する目的で培地中にグルコースやTNFαを添加した場合のhCMEC/D3細胞に対するPS共存の効果を調べるための実験を進めている。

3. 脳循環代謝に関する研究

　臨床薬として、深部静脈血栓症、急性肺血栓塞栓症、電撃型紫斑病に対する政府認可を得ているヒト血液製剤（活性化プロテインC、APC）を、独自開発したマウス局所脳虚血（3血管閉塞）モデルの急性期静脈内投与によって、虚血時の脳血流（虚血ストレスの深度）には影響を与えずに、慢性期の脳梗塞を縮小させ、脳神経脱落症状を改善させることを見出した。
また、2001年から臨床使用されている政府認可を有する世界で唯一の脳保護薬Edaravoneの急性期静脈内投与のマウス脳梗塞および脳神経機能障害への影響を調べたところ、慢性期の脳梗塞体積に関しては有意な縮小効果が認められたが、神経機能障害（神経脱落症状）においては有意な改善が見られなかった。すなわち、すでに観察されていたAPC投与による急性虚血性脳卒中に対する脳保護効果に比し、Edaravoneは機能保護の面で劣る可能性が示唆された。この研究成果を、2019年日本脳卒中学会（Brain 2019）にて報告した。現在、論文投稿中である。

1. Fujimura Y, Lämmle B, Tanabe S, Sakai K, Kimura T, Kokame K, Miyata T, Takahashi Y, Taniguchi S, Matsumoto M. Patent ductus arteriosus generates neonatal hemolytic jaundice with thrombocytopenia in Upshaw-Schulman syndrome. Blood Advances. 3, 3191-3195, 2019.
2. van Dorland HA, Taleghani MM, Sakai K, Friedman KD, George JN, Hrachovinova I, Knobl PN, von Krogh AS, Schneppenheim R, Aebi-Huber I, Butikofer L, Largiader CR, Cermakova Z, Kokame K, Miyata T, Yagi H, Terrell DR, Vesely SK, Matsumoto M, Lammle B, Fujimura Y, Hovinga JAK. The International Hereditary Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Registry: key findings at enrollment until 2017. Haematologica. 104, 2107-2115, 2019.
3. Miyoshi T, Oku H, Asahara S, Okamoto A, Kokame K, Nakai M, Nishimura K, Otsuka F, Higashiyama A, Yoshimatsu J, Miyata T. Effects of low-dose combined oral contraceptives and protein S K196E mutation on anticoagulation factors: a prospective observational study. International Journal of Hematology. 109, 641-649, 2019.
4. Nakajo Y, Zhao Q, Enmi JI, Iida H, Takahashi JC, Kataoka H, Yamato K, Yanamoto H. Early Detection of Cerebral Infarction After Focal Ischemia Using a New MRI Indicator. Molecular Neurobiology. 56, 658-670, 2019.
5. Ono S, Matsui H, Noda M, Kasuda S, Yada N, Yoshimoto K, Akiyama M, Miyata T, Sugimoto M, Nishio K. Functional regulation of von Willebrand factor ameliorates acute ischemia-reperfusion kidney injury in mice. Scientific Reports. 9, 14453, 2019.
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7. Nakajima-Doi S, Seguchi O, Shintani Y, Fujita T, Fukushima S, Matsumoto Y, Eura Y, Kokame K, Miyata S, Matsuda S, Mochizuki H, Iwasaki K, Kimura Y, Toda K, Kumai Y, Kuroda K, Watanabe T, Yanase M, Kobayashi J, Fukushima N. Experience of the use of octreotide for refractory gastrointestinal bleeding in a patient with Jarvik2000^® left ventricular assist device. Journal of Artificial Organs. 22, 334-337, 2019.
8. Horiuchi H, Doman T, Kokame K, Saiki Y, Matsumoto M. Acquired von Willebrand Syndrome Associated with Cardiovascular Diseases. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 26, 303-314, 2019.
9. 秋山 正志, 小亀 浩市. ADAMTS13の構造変化と機能発現. Thrombosis Medicine. 9, 196-205, 2019.