病態代謝部
研究活動の概要

　病態代謝部においては循環器疾患の克服を目的として、重篤な循環器疾患発症の基礎となる脂質代謝異常の発症機序や病態生理を解明すること、さらに動脈硬化症発症や進展へのメカニズムを解明し、有効な治療法の開発に関わる研究を、循環器および代謝内科学、病理学、分子生物学、材料工学、薬学、生化学、細胞生物学などの知識および技術を用いて実施している。

　病態代謝部では、特に重篤な循環器疾患を合併する脂質代謝異常として、家族性高コレステロール血症(FH)の臨床研究とそれに基づく診療指針の作成を行ってきた。FH及びFH疑いに対する遺伝子解析は1500例を超え、診断に役立てるとともに遺伝子解析結果による重症群の選別(Hori, Harada-Shiba et al. J Clin Lipidol, 2019)、既知の遺伝子変異を有しない150家系のWhole genome解析およびexome解析を行い、FHの新しい病因候補遺伝子の絞り込みを行っている。一方、FHにおいて、HDL機能が独立した動脈硬化性心血管疾患のリスクになることを報告しており、HDL機能を低下させる因子としてHDL分画に含まれるリン脂質に占めるリゾフォスファチジルコリンの含有率が重要であることを見出した。斯波は家族性高コレステロール血症ガイドライン作成委員会の委員長、小倉は委員として動脈硬化性疾患予防ガイドライン2017のFHの項の作成に携わり、原発性高脂血症調査研究班班長としてガイドラインの検証を行っている。小児FH診療指針を発表するなど、日本におけるFHの診療基盤整備に大きな役割を果たしている。

　FHに対する新しい治療法の開発として、当部では新規架橋型人工核酸医薬の開発を行なっている。当部と大阪大学薬学部との共同研究により従来のアンチセンス核酸の、特異性の低さ、体内での易分解性を克服した架橋型人工核酸(BNA)の開発に成功している。当部では、LDL受容体に対する分解活性を有し、機能上昇変異によりFHを呈するPCSK9遺伝子、LDL粒子の主な構成蛋白であるアポリポプロテインB(ApoB)、高TG血症に深く関わり、動脈壁に直接作用して動脈硬化の発症を促すアポリポプロテインCⅢを標的遺伝子として、疾患モデル動物を用いた治療実験を行い、動物におけるPOCを確立するとともに、高い効果と安全性を示すことを報告、カニクイザルを用いた有効性および安全性試験を行い、トリグリセリドが70%低下するなど、高い有効性と安全性を確認している（特許出願準備中）。PCSK9をターゲットとした核酸医薬の開発においては、カニクイザルを用いた薬効確認試験、ラットを用いた毒性試験を通じ、従来のものの40分の1量でも高い効果を示すアンチセンスの作製に成功しており、特許出願を行っている。ヒト肝臓キメラマウスを用いてスクリーニングにおける有用性を明らかにした。現在、これらのアンチセンスの臨床化に向けた開発に取り組んでいる。

2018年の主な研究成果
  1. 家族性高コレステロール血症(FH)の臨床研究　（1）遺伝子解析
    　本年度は、LDLR・PCSK9遺伝子において、これまでに検出されたバリアントのアノテーションを行うとともに、40歳未満の若年性冠動脈疾患ではLDLR遺伝子の病的バリアントの寄与が大きいこと、40歳以上の冠動脈疾患では一般的な冠動脈疾患リスク因子の寄与が大きいことを明らかにした (Hori, Harada-Shiba et al. in revision、Hori, Harada-Shiba et al. JCL, 2019)。また、FH148家系293名について、原因遺伝子を明らかにするために全ゲノム・エクソーム解析を実施している。本年度は全ゲノムシーケンスの情報解析により、LDLR遺伝子に存在するエクソン2～6を含む大きな挿入箇所を厳密に同定し、MLPA法及びサンガー法により確認した(投稿準備中)。
  2. 家族性高コレステロール血症(FH)の臨床研究　（2）遺伝子解析による冠動脈疾患リスク層別化
    　当部では、FH遺伝子変異による冠動脈疾患の層別化を目的とし、多方面から解析を実施している。本年度は、当センターにて遺伝子診断された269名のFH患者において、LDLR・PCSK9遺伝子のダブルヘテロ変異を有する患者ではLDL-コレステロール値は管理されているにもかかわらず主要心血管イベントが多く、予後が悪いことを明らかにした (Doi, Hori, Harada-Shiba et al. 投稿中)。
  3. 家族性高コレステロール血症(FH)の臨床研究　（3）LDLアフェレシス治療効果のメカニズム解析
    　LDLアフェレシス排液を用いて蛋白質のLC-MS解析を行い、凝固、炎症、血栓関連及び接着因子等、多くの蛋白質を同定した。FH患者のLDLアフェレシス排液を用いたLC-MS解析により同定された蛋白質をLDLアフェレシス前後の血清で測定し、実際に血中から除去されていることを確認し、論文投稿準備中である。
  4. 新規架橋型人工核酸搭載アンチセンス医薬の開発　（1）PCSK9
    　昨年度に引き続き、ヒト肝臓キメラマウスを用いてPCSK9を標的とするアンチセンス医薬の活性および安全性の評価を行った。標的となるPCSK9 mRNAに対する作用だけではなく、血中のヒトPCSK9タンパク質に対する効果を確認した。ヒト肝臓キメラマウスは正常な野生型マウスとは薬物動態が異なり、安全性を評価する上では工夫が必要である一方で、ヒトの肝臓に対する薬効を予測する上では有用なモデル動物であることが示唆された。
  5. 新規架橋型人工核酸搭載アンチセンス医薬の開発　（2）apoC-III
    　これまでの研究開発より得られた医薬品候補となる抗apoC-IIIアンチセンスのヒトに対する活性を予測するために、ヒト肝臓キメラマウスに対する投与試験を実施した。その結果、先行して研究してきた抗PCSK9アンチセンスと同等の効果を確認できたため、続いてカニクイザルに対する投与試験を実施した。投与した2匹のカニクイザルは、どちらも血中トリグセリド値が70%低下し、ヒトに対する有効性を示唆する結果が得られた。
  6. 遺伝子改変マウスを用いたニューロメジンU(NMU)の脂質代謝及び炎症との関わりに関する研究
    　NMUの脂質代謝における役割を明らかにするため、Apoe-/-Nmu-/- マウスを作製し、病態解析を行った。Apoe-/-Nmu-/- マウスでは、Apoe-/- マウスに比較して、血清脂質の顕著な上昇が認められたが、動脈硬化性病変の進展に差は認められなかった。Nmu-/- マウスは、高コレステロール食負荷により、WT に比し、重度の脂肪性肝炎が誘発され、肝臓において脂質代謝関連遺伝子と共に時計遺伝子の発現が変動していることを見出した。
  7. 高比重リポ蛋白（HDL）の機能に関する臨床研究
    　善玉リポ蛋白と考えられているHDLの機能のうち、マクロファージからのコレステロール引き抜き能や抗酸化力のアッセイを確立した。現在、予防検診部、心臓血管内科、脳神経内科、糖尿病・脂質代謝内科、小児科との共同研究を進めており、HDL機能が新しいリスクマーカーおよび治療ターゲットとなりうるかについて検討を進めている。FHにおけるHDL機能を低下させる因子としてHDL分画に含まれるリン脂質に占めるリゾフォスファチジルコリンの含有率が重要であることを見出した（2019年動脈硬化学会発表予定）。
  8. 間葉系幹細胞培養上清（MSC-CM）を用いた新規動脈硬化性疾患予防及び治療法の開発
    　本年度は、MSC-CM中のどの分子が抗動脈硬化作用を担うのかを明らかにするため、MSC-CMをタンパク画分とエクソソーム画分に分離し、ヒト単球と血管内皮細胞の共培養により、全画分が単球の血管内皮細胞への接着を抑制することを示した。また、タンパク画分には、HGFが含まれており、HGF単体でも単球の接着抑制効果が認められた。MSC-CM及びタンパク画分に、抗HGF抗体を加えることで、単球の接着抑制効果は減弱したが、抑制効果は有意に残っており、MSC-CM中の他のタンパク成分も接着抑制効果を担っていることを明らかにし、論文発表を行った (Takafuji, Hori, Harada-Shiba et al. Cardiovasc Res. 2019)。
  9. アンチセンス核酸の腎蓄積を軽減させるcholesterol-GalNAcデュアル修飾の開発
    　抗PCSK9アンチセンス薬の開発を進める中で、アンチセンス薬には潜在的に腎毒性のリスクがあることが明らかとなり、GalNAc修飾などのような薬物送達技術の応用がそのリスクを軽減させるアプローチとして有効であることを見出した。したがって、アンチセンス薬の腎臓への蓄積をさらに軽減するために、GalNAc修飾アンチセンスに対して脂溶性の高いコレステロールをさらに接合する設計を考案した。
  10. Glucagon-like peptide-1受容体作動薬が血清LDL-コレステロール値に及ぼす影響についての検討
    　GLP-1RAは、臨床において脂質値をも改善すると報告されているがその詳細な機序は不明である。本年度は、疾患モデルマウスを用いてGLP-1RAのLDL-C低下作用が認められることを確認し、その分子機序について検討している。
研究業績
  1. Vallejo-Vaz AJ, De Marco M, Stevens CAT, Akram A, Freiberger T, Hovingh GK, Kastelein JJP, Mata P, Raal FJ, Santos RD, Soran H, Watts GF, Abifadel M, Aguilar-Salinas CA, Al-Khnifsawi M, AlKindi FA, Alnouri F, Alonso R, Al-Rasadi K, Al-Sarraf A, Ashavaid TF, Binder CJ, Bogsrud MP, Bourbon M, Bruckert E, Chlebus K, Corral P, Descamps O, Durst R, Ezhov M, Fras Z, Genest J, Groselj U, Harada-Shiba M, Kayikcioglu M, Lalic K, Lam CSP, Latkovskis G, Laufs U, Liberopoulos E, Lin J, Maher V, Majano N, Marais AD, Marz W, Mirrakhimov E, Miserez AR, Mitchenko O, Nawawi HM, Nordestgaard BG, Paragh G, Petrulioniene Z, Pojskic B, Postadzhiyan A, Reda A, Reiner Z, Sadoh WE, Sahebkar A, Shehab A, Shek AB, Stoll M, Su TC, Subramaniam T, Susekov AV, Symeonides P, Tilney M, Tomlinson B, Truong TH, Tselepis AD, Tybjaerg-Hansenb A, Vazquez-Cardenas A, Viigimaa M, Vohnout B, Widen E, Yamashita S, Banach M, Gaita D, Jiang LX, Nilsson L, Santos LE, Schunkert H, Tokgozoglu L, Car J, Catapano AL, Ray KK. Overview of the current status of familial hypercholesterolaemia care in over 60 countries - The EAS Familial Hypercholesterolaemia Studies Collaboration (FHSC). Atherosclerosis. 277, 234-255, 2018.
  2. Harada-Shiba M, Ako J, Arai H, Hirayama A, Murakami Y, Nohara A, Ozaki A, Uno K, Nakamura M. Prevalence of familial hypercholesterolemia in patients with acute coronary syndrome in Japan: Results of the EXPLORE-J study. Atherosclerosis. 277, 362-368, 2018.
  3. Hayashi J, Nishigaki M, Ochi Y, Wada S, Wada F, Nakagawa O, Obika S, Harada-Shiba M, Urata H. Effective gene silencing activity of prodrug-type 2'-O-methyldithiomethyl siRNA compared with non-prodrug-type 2'-O-methyl siRNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28, 2171-2174, 2018.
  4. Tanaka E, Ogawa Y, Mukai T, Sato Y, Hamazaki T, Nagamura-Inoue T, Harada-Shiba M, Shintaku H, Tsuji M. Dose-Dependent Effect of Intravenous Administration of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells in Neonatal Stroke Mice. Frontiers In Neurology. 9, 133, 2018.
  5. Shirahama R, Ono T, Nagamatsu S, Sueta D, Takashio S, Chitose T, Fujisue K, Sakamoto K, Yamamoto E, Izumiya Y, Kaikita K, Hokimoto S, Hori M, Harada-Shiba M, Kajiwara I, Ogawa H, Tsujita K. Coronary Artery Plaque Regression by a PCSK9 Antibody and Rosuvastatin in Double-heterozygous Familial Hyper-cholesterolemia with an LDL Receptor Mutation and a PCSK9 V4I Mutation. Internal Medicine. 57, 3551-3557, 2018.
  6. Harada-Shiba M, Kastelein JJP, Hovingh GK, Ray KK, Ohtake A, Arisaka O, Ohta T, Okada T, Suganami H, Wiegman A. Efficacy and Safety of Pitavastatin in Children and Adolescents with Familial Hypercholesterolemia in Japan and Europe. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25, 422-429, 2018.
  7. Hasegawa Y, Hori M, Nakagami T, Harada-Shiba M, Uchigata Y. Glucagon-like peptide-1 receptor agonists reduced the low-density lipoprotein cholesterol in Japanese patients with type 2 diabetes mellitus treated with statins. Journal of Clinical Lipidology. 12, 62-69, 2018.
  8. D'Erasmo L, Minicocci I, Nicolucci A, Pintus P, Van Lennep JER, Masana L, Mata P, Sanchez-Hernandez RM, Prieto-Matos P, Real JT, Ascaso JF, Lafuente EE, Pocovi M, Fuentes FJ, Muntoni S, Bertolini S, Sirtori C, Calabresi L, Pavanello C, Averna M, Cefalu AB, Noto D, Pacifico AA, Pes GM, Harada-Shiba M, Manzato E, Zambon S, Zambon A, Vogt A, Scardapane M, Sjouke B, Fellin R, Arca M. Autosomal Recessive Hypercholesterolemia Long-Term Cardiovascular Outcomes. Journal of the American College of Cardiology. 71, 279-288, 2018.
  9. Sturm AC, Knowles JW, Gidding SS, Ahmad ZS, Ahmed CD, Ballantyne CM, Baum SJ, Bourbon M, Carrie A, Cuchel M, de Ferranti SD, Defesche JC, Freiberger T, Hershberger RE, Hovingh GK, Karayan L, Kastelein JJP, Kindt I, Lane SR, Leigh SE, Linton MF, Mata P, Neal WA, Nordestgaard BG, Santos RD, Harada-Shiba M, Sijbrands EJ, Stitziel NO, Yamashita S, Wilemon KA, Ledbetter DH, Rader DJ. Clinical Genetic Testing for Familial Hypercholesterolemia. Journal of the American College of Cardiology. 72, 662-680, 2018.
  10. Wada F, Yamamoto T, Ueda T, Sawamura M, Wada S, Harada-Shiba M, Obika S. Cholesterol-GalNAc Dual Conjugation Strategy for Reducing Renal Distribution of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 28, 50-57, 2018.
  11. Otani K, Nishimura H, Kamiya A, Harada-Shiba M. Simplified Preparation of αvβ3 Integrin-Targeted Microbubbles Based on a Clinically Available Ultrasound Contrast Agent: Validation in a Tumor-Bearing Mouse Model. Ultrasound in Medicine and Biology. 44, 1063-1073, 2018.
  12. Harada-Shiba M, Arai H, Ishigaki Y, Ishibashi S, Okamura T, Ogura M, Dobashi K, Nohara A, Bujo H, Miyauchi K, Yamashita S, Yokote K; Working Group by Japan Atherosclerosis Society for Making Guidance of Familial Hypercholesterolemia. Guidelines for Diagnosis and Treatment of Familial Hypercholesterolemia 2017. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25, 751-770, 2018.
  13. Harada-Shiba M, Ohta T, Ohtake A, Ogura M, Dobashi K, Nohara A, Yamashita S, Yokote K; Joint Working Group by Japan Pediatric Society and Japan Atherosclerosis Society for Making Guidance of Pediatric Familial Hypercholesterolemia. Guidance for Pediatric Familial Hypercholesterolemia 2017. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25, 539-553, 2018.
  14. Ogura M. PCSK9 inhibition in the management of familial hypercholesterolemia. Journal of Cardiology. 71, 1-7, 2018.
  15. Takahashi M, Hori M, Ishigamori R, Mutoh M, Imai T, Nakagama H. Fatty pancreas: A possible risk factor for pancreatic cancer in animals and humans. Cancer Science. 109, 3013-3023, 2018.
  16. Kakuta T, Fujita T, Fukushima S, Kawamoto N, Matsumoto Y, Yamashita K, Shimahara Y, Ishibashi-Ueda H, Harada-Shiba M, Kobayashi J. Two Cases of Surgical Management of Supravalvular Aortic Stenosis in Familial Hypercholesterolemia. The Annals of Thoracic Surgery. 105, e171-e174, 2018.
  17. 小倉 正恒, 斯波 真理子. PCSK9阻害薬. medicina 4月増刊 プライマリ・ケアでおさえておきたい重要薬・頻用薬. 55, 298-301, 2018.
  18. 小倉 正恒. PCSK9阻害薬は実際どのような症例に使用するのでしょうか? スタチンとの違いも含めて教えて下さい. レジデントノート 増刊 循環器診療のギモン、百戦錬磨のエキスパートが答えます. 20, 838-844, 2018.
  19. 山本 雅, 小倉 正恒, 斯波 真理子. LDLコレステロールと心血管病. The Lipid. 29, 64-71, 2018.
  20. 小倉 正恒. 私の処方：家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体患者. Modern Physician. 38, 1183, 2018.
  21. 小倉 正恒, 和田 郁人, 斯波 真理子. 原発性高TG血症治療の現状と新薬開発状況. 最新醫學別冊 診断と治療のABC 138 高TG血症. 184-191, 2018.
  22. 小倉 正恒, 斯波 真理子. 家族性高コレステロール血症の分子標的. 循環器専門医. 27, 64-71, 2018.
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  24. 小倉 正恒, 斯波 真理子. PCSK9阻害薬を用いた脂質低下治療の展望と課題. 最新醫学. 73, 834-842, 2018.
  25. 伊藤 浩, 小倉 正恒. 対談 私が考えるこれからの冠動脈疾患治療 -New Era of Biologics is Dawning-. nature REVIEWS CARDIOLOGY 日本語版. 11, 184-186, 2018.
  26. 小倉 正恒, 斯波 真理子. 疾患レビュー・治療抵抗性高コレステロール血症. スズケンメディカル. 21, 4-6, 2018.
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