細胞間情報伝達は、生体を精巧に制御するための最も基本的なメカニズムであり、循環動態をはじめとする生体のホメオスタシスの維持に重要な役割を果している。生化学部では、細胞間情報伝達を担う生理活性物質の中でも特にペプチド性因子に着目して新規に検索し、それによる未知の情報伝達および生体制御機構の解明に取り組んでいる。新規ペプチドの探索は容易ではないが、その発見は非常に大きなインパクトを与えるだけでなく、全く異なった視点での研究展開をもたらす。実際、我々のグループによる心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）（1984年）や脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）（1988年）の発見によって、それまでポンプとしてのみ機能すると考えられていた心臓が、ホルモンを分泌する内分泌器官として位置付けられた。また、脳から発見したC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）（1990年）が血管内皮細胞から分泌されるため、血管壁もペプチドホルモンを分泌する内分泌組織として捉えられた。一方で、これらの生理活性ペプチドの発見を基盤とした臨床応用研究も推進しており、その成果として、ANPとBNPは、それぞれ心不全の治療および診断薬として臨床応用されている。このように新しい生理活性物質の発見は、それまで考えも及ばなかった制御系の存在を明示すると共に、新しい診断・治療薬の開発に繋がることも期待できる。
　上記のような研究の経緯を背景として、生化学部では新規生理活性ペプチドの探索による循環調節因子の発見を優先課題としており、そのための新しい活性測定法や精製手技からなる探索法や構造解析法の開発を行っている。その結果として、CNPに続く新しい循環調節ペプチドとしての“アドレノメデュリンおよびPAMPの発見”（1993年）や“グレリンの発見”（1999年）、オーファン受容体GPR66（FM3）の内因性リガンドとしての“ニューロメジンUの同定”（2000年）、さらに“ニューロメジンSの発見”（2005年）や“新規ペプチドneuromedin U precursor-related peptide (NURP)の発見”（2017年）などに繋げた。また近年では、肥満に脂質異常症、高血圧、糖尿病といった代謝性疾患が重積する疾患概念であるメタボリックシドロームが動脈硬化性疾患の基盤になるため、肥満発症機構の理解と制御を目的として、摂食・エネルギー代謝調節に関与する未知のペプチド性生理活性物質の探索も実施している。
　生化学部で発見したペプチドについては、遺伝子発現および分泌調節、作用機序や新たな生理機能の解明などの基礎的研究を進めると共に、当センター研究所、病院およびセンター外の研究グループと連携して、病態生理的意義の解明や新しい診断、治療薬としての臨床応用を目指しての研究も進めている。
　一方、上記ペプチドの他にも、当研究グループで既に発見またはクローニングした骨形成タンパク質（BMP-3b）とグアニリンペプチドファミリーなどについても、新たな機能解析や病態生理的意義の解明に関しての研究を進めている。

○生化学部では、新規物質を基盤として、具体的には主に以下のテーマの研究を行っている。

1. 新規成長ホルモン分泌促進ペプチド; グレリン(Ghrelin) に関する研究
2. アドレノメデュリン(Adrenomedullin : AM)とPAMPによる新しい循環調節機構の解明
3. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー(ANP, BNP, CNP) の新たな機能解明
4. ニューロメジンUとニューロメジンSに関する新たな研究
5. グアニリン・ファミリーの新たな機能に関する研究
6. Bone Morphogenetic Protein-3bの新たな機能に関する研究
7. 新しい活性検出法を用いた新規生理活性ペプチドの探索に関する研究

1. グレリン（Ghrelin）に関する研究
• グレリンは、主に胃底腺のX/A like cellから分泌され、胃周辺の迷走神経末端に作用して、延髄孤束核を介して情報を中枢に伝達する。またグレリンは、交感神経活動を抑制し、副交感神経活動を賦活化することにより、急性心筋梗塞モデル動物における急性期死亡を減少させ、慢性期心臓リモデリングを抑制するなど、循環器疾患における機能も検討している。胃から分泌されたグレリンによる摂食情報は、胃周辺の迷走神経末端から、迷走神経節および孤束核に到達し、孤束核から視床下部へはノルアドレナリン神経系を介して伝達されることを明らかにした。また、グレリン投与は、急性心筋梗塞モデルラットの交感神経活動を抑制して急性期死亡を減少させるため、虚血性心疾患におけるグレリンの有用性が示された。

  ①29年度は、グレリンの上記作用がアセチルコリンを神経伝達物質とするニューロンを介したものであることを証明する為、cholinergic neuron特異的グレリン受容体 (GHS-R)ノックアウトマウスに心筋梗塞モデルを作製し、生存率を評価した。その結果、対照マウスに比較してcholinergic neuron特異的GHS-Rノックアウトマウスでは、心筋梗塞モデル作製後の生存率が有意に低下した。我々は以前、グレリンノックアウトマウスの心筋梗塞モデル作製後の生存率が、野生型マウスに比較し有意に低下することを報告したが、29年度の我々の検討により、内因性グレリンがcholinergic neuronのGHS-Rを介して、心筋梗塞モデル作製後の生存率向上に寄与していることが明らかとなった。

• グレリンや受容体の構造と分子進化、また活性とそれらの関連を明らかにするため、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの非哺乳類を材料に研究を進めている。これまで、両生類のアカガエル属では脂肪酸修飾された3番目のアミノ酸が哺乳類のセリンからスレオニンに置換していること、魚類のグレリンはC末端がアミド化されていることなど哺乳類にはないユニークな構造をもつこと、またグレリンが魚類、両生類、鳥類でも下垂体から成長ホルモン分泌を促したり、摂食を調節することなど、グレリンの分子進化や構造、活性について特異かつ重要な知見を得ている。

  ②モルモットのグレリンは同じげっ歯類のラットと比べて７つアミノ酸が異なっており、変異は保存領域まで及んでいた。胃腸管における産生細胞の分布は似ていたが、腸管運動には効かず、摂食は亢進され、血中グルコース濃度の上昇が見られた。また、非アシル化グレリンが鳥の渡り行動の誘発に関与する可能性を示した。

2. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー（ANP, BNP, CNP）に関する研究
• ３種のナトリウム利尿ペプチド（NP）のうち、ANPとBNPは心筋細胞より分泌され、主に循環ホルモンとして機能する。ANPとBNPの機能的共通受容体であるguanylate cyclase-A(GC-A)は、血管内皮細胞に豊富に存在するため、ANPとBNPが血管恒常性維持ホルモンとして作用している可能性がある。

  ①マウス不死化内皮細胞にGC-Aを安定発現させ、ANPの細胞内シグナル伝達経路を解析したところ、(1)ANPが低分子量Gタンパク質Rac1を活性化し、RhoAを不活性化する事、(2)ANPによる内皮細胞のバリア機能の亢進において、セリン/スレオニンキナーゼPAK4と、脳海綿状血管腫の原因遺伝子CCM2が必要である事が明らかとなった。またGC-Aに変異を導入する事により、細胞内domainのどの領域がGC-Aの機能に重要か解析したところ、(3)guanylate cyclase domainに加え、kinase homology domainもバリア機能の亢進に必要である事、および(4)kinase homology domainはANP依存的なGC-AとCCM2との相互作用に必須で有る事が明らかとなった。以上の結果からGC-Aの機能におけるkinase homology domainの重要性が示された。

• CNPは、ANP/BNPと異なるguanylate cyclase-B(GC-B)受容体を介して作用し、これまでに動物実験レベルで心・血管・肺・腎などに対して抗炎症・抗線維化効果が報告されている。

  ②肥満・糖尿病が血管機能障害であること及びCNPの有する血管機能障害改善作用に着目し、CNPの肥満・糖尿病における作用を検討した。CNPを血管内皮細胞特異的に過剰発現させたマウスが、肥満モデルにおいて脂肪細胞肥大化、耐糖能、炎症作用改善作用に加え、エネルギー消費亢進作用を示したことから、CNPの血管機能障害改善作用による抗肥満作用が示唆された。

3. ニューロメジンUとニューロメジンSに関する新たな研究
• ニューロメジンU（NMU）とニューロメジンS（NMS）は、当研究室で発見した神経ペプチドであり、同一の活性部位を有するため共通の受容体(1型および2型)を介して機能する。これまでに、NMUとNMSの代表的な機能として、中枢性摂食・エネルギー代謝調節やサーカディアンリズムの形成、血圧・心拍数増加による循環調節、中枢性体温調節などを示した。また、中枢においてNMSとNMUは同様の作用を誘発するが、興味深いことにNMSの活性はNMUに比して約10倍強力であった。近年では、NMU/NMS受容体の選択的アゴニストを開発している。

  ①NMUの前駆体の構造解析により、この前駆体タンパク質から産生される新たな生理活性ペプチドを同定した。NMUの前駆体タンパク質には、翻訳後修飾で切断されうる典型的な配列が4つ存在し、これらは前駆体構造が判明している全ての動物種で保存されている。このため、NMU配列のN末端側に存在する2つが切断されることにより新たなペプチドが産生されることが強く示唆された。そこで、抗体アフィニティーカラムを用いてこのペプチドをラット脳から精製することにより、その存在を証明し、新規生理活性ペプチドneuromedin U precursor-related peptide (NURP)と命名した。また、NURPをラットの脳室内へ投与すると、プロラクチンの分泌を促進することを見出した。

4. 腸管生理活性ペプチド“グアニリン・ファミリー”の機能発現調節に関する研究
• 水・電解質の代謝調節を主要な生理作用とするグアニリン・ファミリー(guanylin (Gu)とuroguanylin (Ugu))は、細胞膜内在型グアニル酸シクラーゼguanylate cyclase C (GC-C)を共通受容体とする。Guは十二指腸以下の消化管粘膜に限局して高発現し、Uguは消化管に加え腎臓、肺、膵臓にも発現が認められ、GC-Cは消化管に高発現している。これまでGuとUguの水・電解質代謝能を含めた多様な生理活性の作用機序を理解するため、GC-Cの活性調節メカニズムの解析を行った。その結果、GC-C分子自身がグアニル酸シクラーゼ(GC)活性とGcとUguのリガンド選択性を調節することを明らかにした。更に、GC-Cの細胞内シグナル伝達メカニズムに関わる、複数の直接相互作用する活性調節因子を見出した。これらの結果はGuとUguの生理活性は、各標的組織（部位）毎に異なる構成のGC-Cと活性調節因子を含む高次複合体により発揮される可能性を示唆している。

  ①今回、GC-Cと活性調節因子の結合様式を検討する為に、多因子間の相互作用を同時に検出する実験系を確立した。これより得られるGC-CとNHERFsの相互作用領域のデータから、シミュレーションにより特異的阻害剤をデザインし絞り込むことが可能であり、これにより創薬へと繋がる重要な知見が得られるものと考えられる。また加えて、GC-C以外の受容体型GCと活性調節因子との相互作用についても解析を行ったところ、GC-A,-Bが共にGC活性の調節を受けることが明らかとなり、受容体型GCにはこの活性調節因子が関与する細胞内シグナル伝達メカニズムが共通に存在していることが示唆された。

5. Bone Morphogenetic Protein-3bの新たな機能に関する研究
• Bone Morphogenetic Protein-3b (BMP-3b)は、我々が骨組織より1996年に同定したタンパク質である。BMP-3bは、構造上BMPファミリーに属するが、他のBMPファミリーとは異なる独自の作用を有している。例えば、Smad2/3系を介した骨形成抑制作用や、脂肪細胞分化抑制作用、また、初期胚発生過程での、頭部・神経誘導作用がある。BMP-3bは、循環調節に重要な部位に存在しており、これら組織における新たな機能解明を目指した研究を推進している。

  ①循環器疾患の基盤となる肥満におけるBMP-3bの機能解析の為、BMP-3bを脂肪組織特異的に過剰発現するマウス（Tg）を作出し、それがエネルギー消費亢進やインスリン感受性亢進、脂肪細胞肥大化抑制を伴う抗肥満の表現型を呈した。また、Tgでは抗肥満作用はあるものの、摂食量が増加していることや視床下部でのBMP-3bの発現増加していることより、中枢神経系によるエネルギー代謝調節機構も示唆された。

6. 新しい活性検出法の構築と新規生理活性ペプチドの探索に関する研究
• 生理活性ペプチドは、それぞれ特異的な受容体を介して細胞に情報を伝達しており、受容体の多くはGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。従来より、リガンドが不明なため機能が知られてないGPCR遺伝子（オーファンGPCR）は数多く存在し、内因性リガンド探索による新規ペプチドの同定が期待されている。これまでに、生化学部ではこの手法を用いて、グレリンやニューロメジンU、ニューロメジンSを単離・同定している。現在でも新たな活性検出法を導入し、未知のペプチド探索を進めている。

  リガンド結合による標的GPCRの活性化を検出するためには、共役する4種類のGαタンパク質が伝達する細胞内シグナルについて、それぞれ測定する必要がある。なかでもGα_12/13に共役するオーファンGPCRのリガンド探索は、下流シグナルを簡便かつ多検体同時に検出する系が存在せず、十分に進んでいない。平成29年度は、上記課題を克服した新たなアッセイ系（TGFα切断アッセイ）が組織抽出物からの標的GPCRに対するリガンド探索に有用であるか検証した。従来の活性検出系（細胞内Ca²⁺上昇等）に比べ検出感度は下がるが、特異性の非常に高いアッセイ系であることを明らかにした。本アッセイ法は、オーファンGPCRの内因性リガンド探索において有効であり、今後の成果が期待される。

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