細胞間情報伝達は、生体を精巧に制御するための最も基本的なメカニズムであり、循環動態をはじめとする生体のホメオスタシスの維持に重要な役割を果している。そこで生化学部では、細胞間情報伝達を担う生理活性物質の中でも特にペプチド性因子に着目して新規に検索し、それによる未知の情報伝達および生体制御機構の解明に取り組んでいる。新規ペプチドの探索は容易ではないが、その発見は非常に大きなインパクトを与えるだけでなく、全く異なった視点での研究展開をもたらす。実際、我々のグループによる心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）（1984年）や脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）（1988年）の発見によって、それまでポンプとしてのみ機能すると考えられていた心臓が、ホルモンを分泌する内分泌器官として位置付けられた。また、脳から発見したC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）（1990年）が血管内皮細胞から分泌されるため、血管壁もペプチドホルモンを分泌する内分泌組織として捉えられた。一方で、これらの生理活性ペプチドの発見を基盤とした臨床応用研究も推進しており、その成果として、ANPとBNPは、それぞれ心不全の治療および診断薬として臨床応用されている。また、心筋梗塞後の線維芽細胞が産生するCNPの線維化抑制作用も注目されている。このように新しい生理活性物質の発見は、それまで考えも及ばなかった制御系の存在を明示すると共に、新しい診断・治療薬の開発に繋がることも期待できる。

上記のような研究の経緯を背景として、生化学部では新規生理活性ペプチドの探索による循環調節因子の発見を優先課題としており、そのための新しい活性測定法や精製手技からなる探索法や構造解析法の開発を常に行っている。その結果として、CNPに続く新しい循環調節ペプチドとしての“アドレノメデュリンおよびPAMPの発見”（1993年）や“グレリンの発見”（1999年）、オーファン受容体GPR66（FM3）の内因性リガンドとしての“ニューロメジンUの同定”（2000年）、さらに“ニューロメジンSの発見”（2005年）などに繋げた。また近年では、肥満に脂質異常症、高血圧、糖尿病といった代謝性疾患が重積する疾患概念であるメタボリックシドロームが動脈硬化性疾患の基盤になるため、肥満発症機構の理解と制御を目的として、摂食・エネルギー代謝調節に関与する未知のペプチド性生理活性物質の探索も実施している。

1. グレリン（Ghrelin）に関する研究
• 1999年に当研究室で発見したグレリンは、成長ホルモン分泌促進ペプチドとして同定したが、これまでに食欲促進、エネルギー代謝調節、循環調節など多様な機能を明らかにし、生体のホメオスタシスの維持に働くホルモンであることを示してきた。また、血中グレリン濃度は、心不全や慢性閉塞性肺疾患(COPD)、拒食症におけるカヘキシアなどの低栄養状態で高値、肥満で低値を示し、BMIと負の相関を示すことを明らかにした。さらにグレリンの慢性投与により、慢性心不全患者の左室機能や運動耐用能が改善すること、COPD患者の運動能の改善傾向を認め、心肺運動負荷試験における最高酸素摂取量や呼吸筋力、自覚症状の有意な改善を認めた。また、食道切除術後5日間のグレリン投与は、全身性炎症反応症候群からの早期回復をうながし術後肺合併症の発生頻度を低下させることを示した。これらの結果は、グレリンの新たな疾患治療薬としての可能性を示した。
  ①今回、抗癌剤であるシスプラチンの腎毒性に対するグレリンの効果を検討した結果、グレリン前投与により、シスプラチンによる血清BUNやクレアチニンの上昇が抑制され、腎尿細管障害やアポトーシスも改善していた。また、腎臓のMCP-1, IK-6, KIM-1, NGAL mRNA発現も抑制した。グレリンのシスプラチン誘導性腎毒性の予防薬としての可能性を示した。
• グレリンは、主に胃底腺のX/A like cellから分泌され、胃周辺の迷走神経末端に作用して、延髄孤束核を介して情報を中枢に伝達する。またグレリンは、交感神経活動を抑制し、副交感神経活動を賦活化することにより、急性心筋梗塞モデル動物における急性期死亡を減少させ、慢性期心臓リモデリングを抑制するなど、循環器疾患における機能も検討している。胃から分泌されたグレリンによる摂食情報は、胃周辺の迷走神経末端から、迷走神経節および孤束核に到達し、孤束核から視床下部へはノルアドレナリン神経系を介して伝達されることを明らかにした。また、グレリン投与は、急性心筋梗塞モデルラットの交感神経活動を抑制して急性期死亡を減少させるため、虚血性心疾患におけるグレリンの有用性が示された。
  ②28年度は、グレリンの上記作用が神経系を介したものであることを証明する為、前年度作製した神経特異的グレリン受容体 (GHS-R)ノックアウトマウスに心筋梗塞モデルを作製し、生存率を評価した。その結果、対照マウスに比較して神経特異的GHS-Rノックアウトマウスでは、心筋梗塞モデル作製後の生存率が優位に低下した。我々は以前、グレリンノックアウトマウスの心筋梗塞モデル作製後の生存率が、野生型マウスに比較し有意に低下することを報告したが、28年度の我々の検討により、内因性グレリンが神経GHS-Rを介して、心筋梗塞モデル作製後の生存率向上に寄与していることが明らかとなった。
• グレリンの構造や分子進化、受容体の構造と活性の関連を明らかにするため、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの非哺乳類を材料に研究を進めている。これまで、両生類のアカガエル属では脂肪酸修飾された3番目のアミノ酸が哺乳類のセリンからスレオニンに置換していること、魚類のグレリンはC末端がアミド化されていることなど、哺乳類にはないユニークな構造をもつこと、またグレリンが魚類、両生類、鳥類でも下垂体から成長ホルモン分泌を促したり、摂食を調節することなど、グレリンの分子進化や構造、活性について特異かつ重要な知見を得ている。
  ③両生類の胃腸管収縮運動に対するグレリンの効果をin vitroで検討したところ、魚類と同様に無効であった。また、常に摂餌をしなければ生存できないモグラのグレリンの分子構造を決定した。さらに、グレリンを含むサケ胃粉末を、ドキソルビシンを投与したマウスに経口摂取することでドキソルビシン誘発性心障害に対する心保護作用が確認された。
2. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー（ANP, BNP, CNP）に関する研究
• ３種のナトリウム利尿ペプチド（NP）のうち、ANPとBNPは心筋細胞より分泌され、主に循環ホルモンとして機能する。ANPとBNPの機能的共通受容体であるguanylate cyclase-Aは、血管内皮細胞に豊富に存在するため、ANPとBNPが血管恒常性維持ホルモンとして作用している可能性がある。
  ①肺癌周術期ANP投与による術後再発抑制効果における詳細な機序として、ANPが血管内皮細胞に作用し、E-selectinの抑制的制御によって、癌転移予防効果を発揮することを示した。本研究を基に、日本全国規模での多施設共同無作為化比較試験(JANP study)を本年度開始し、現在症例登録中である。さらに、抗癌剤とANP併用による新しい癌治療戦略を立案し、機序解明を進めている。
• CNPは、ANP/BNPと異なるguanylate cyclase-B(GC-B)受容体を介して作用し、これまでに動物実験レベルで心・血管・肺・腎などに対して抗炎症・抗線維化効果が報告されている。
  ②CNPについて、肺線維症モデルマウスにおける線維化抑制効果の機序の一つが、線維芽細胞の活性化抑制であることを示した。また、肺線維症や間質性肺炎を有する患者の肺から採取した線維芽細胞を用いて、正常肺由来の線維芽細胞と変わらずGC-B受容体が発現することを確認するとともに、CNPがヒト肺線維芽細胞においてTGF-β刺激による活性化を抑制することを示した。
3. ニューロメジンUとニューロメジンSの新たな機能解明に関する研究
• ニューロメジンU（NMU）とニューロメジンS（NMS）は、当研究室で発見した神経ペプチドであり、同一の活性部位を有するため共通の受容体(1型および2型)を介して機能する。これまでに、NMUとNMSの代表的な機能として、中枢性摂食・エネルギー代謝調節やサーカディアンリズムの形成、血圧・心拍数増加による循環調節などを示した。また、中枢においてNMSとNMUは同様の作用を誘発するが、興味深いことにNMSの活性はNMUに比して約10倍強力であった。近年では、NMU/NMS受容体の選択的アゴニストを開発している。
  ①中枢性体温調節におけるNMUとNMSの役割を検討した。両ペプチドをそれぞれラットへ脳室内投与すると体温が上昇するとともに、体温調節に関わるプロスタグランジンE合成酵素やシクロオキシゲナーゼ2の遺伝子発現量が増加した。このNMSの体温上昇活性は、β3遮断薬やインドメタシンの前投与により阻害された。また、NMSノックアウトマウスでは体温が有意に低下していたが、NMUノックアウトマウスでは変化していなかった。これらは、両ペプチドは体温上昇活性を有するが、生体内ではNMSが体温調節により寄与していることを示唆している。
4. 腸管生理活性ペプチド“グアニリン・ファミリー”の機能発現調節に関する研究
• 水・電解質の代謝調節を主要な生理作用とするグアニリン・ファミリー(guanylinとuroguanylin) は、細胞膜内在型グアニル酸シクラーゼguanylate cyclase C (GC-C)を共通の受容体とし、その機能を発揮する。guanylinは十二指腸以下の消化管粘膜に限局して高発現し、uroguanylinは下部消化管に加え、腎臓、肺、膵臓にも発現が認められ、受容体GC-Cはリガンド同様に消化管に高い発現分布を示す。これまで宮崎大学との共同研究により、高脂肪食に対して肥満耐性を有するラットの解析から、腸間膜脂肪組織のマクロファージにおいてguanylin /GC-Cシグナルが脂肪細胞における脂肪蓄積制御を行うという、新たなguanylinの生理機能を明らかにした。
  ①今回、guanylinとuroguanylinの水・電解質代謝能を含めた多様な生理機能の作用機序をより理解するため、GC-C構造変異体を作製しその活性調節メカニズムの解析を行った。その結果、GC-Cの活性とリガンド選択性を調節している分子内構造を見出した。またGC-Cの活性に影響を与える細胞内の相互作用因子を分子生物学的／生化学的手法により探索した結果、イオンチャネルや交換輸送体と相互作用しその活性調節を行う蛋白質群を見出し、その中でも特に構造が類似した数種のものとGC-Cが直接結合することを明らかにした。この結果は、GC-C受容体が各標的組織（部位）毎に構成の異なる高次複合体を形成し、guanylinとuroguanylinはそれら複合体に作用することにより部位特異的で多様な生理活性を発揮する可能性を示唆している。
5. Bone Morphogenetic Protein-3bの新たな機能に関する研究
• Bone Morphogenetic Protein-3b (BMP-3b)は、我々が骨組織より1996年に同定したタンパク質である。BMP-3bは、構造上BMPファミリーに属するが、他のBMPファミリーとは異なる独自の作用を有している。例えば、Smad2/3系を介した骨形成抑制作用や、脂肪細胞分化抑制作用、また、初期胚発生過程での、頭部・神経誘導作用がある。BMP-3bは、心・血管系組織等の循環調節に重要な部位で、高レベルで存在しており、これら組織における新たな機能解明を目指した研究を推進している。
  ①脂肪細胞からの新たなアディポサイトカインとして機能解明の為、BMP-3bを脂肪組織特異的に過剰発現するマウス（Tg）を作出し、それがエネルギー消費亢進やインスリン感受性亢進を伴う抗肥満の表現型を呈した。また、Tgでは、脂肪肝が顕著に抑制され、肝臓重量や脂肪滴の減少作用を示し、メカニズム解明の結果、肝臓での脂肪酸分解亢進による脂肪肝の抑制作用が明らかとなった。
6. 新しい活性検出法の構築と新規生理活性ペプチドの探索に関する研究
• 生理活性ペプチドは、それぞれ特異的な受容体を介して細胞に情報を伝達しており、受容体の多くはGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。従来より、リガンドが不明なため機能が知られてないGPCR遺伝子（オーファンGPCR）は数多く存在し、内因性リガンド探索による新規ペプチドの同定が期待されている。これまでに、生化学部ではこの手法を用いて、グレリンやニューロメジンU、ニューロメジンSを単離・同定している。現在でも新たな活性検出法を導入し、未知のペプチド探索を進めている。
  ①リガンド結合による標的GPCRの活性化を検出するためには、共役する4種類のG_αタンパク質が伝達する細胞内シグナルについて、それぞれ測定する必要がある。なかでもG_α12/13に共役するオーファンGPCRのリガンド探索は、下流シグナルを簡便かつ多検体同時に検出する系が存在せず、十分に進んでいない。平成28年度は、GPCR活性化に伴うTGF_αの切断活性を指標とした新たなアッセイ系を構築した。本アッセイ系を用いて、G_αq/11及びG_α12/13活性化を簡便かつ多検体同時に検出することに成功した。また、G_αキメラタンパク質を活用することにより、4種すべてのサブタイプの活性化を検出可能であることが示された。本アッセイ法は、オーファンGPCRの内因性リガンド探索において有効であり、今後の成果が期待される。

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