“あるがままの生体”の生理学的観察を基本として、心臓・血管機能の神経・液性調節機構を、分子から個体への統合的視点で研究している。また、生理的知見を基に、循環器病における中枢・末梢神経性調節破綻の機序及びその病態生理的意義に焦点を当て、その解明とそこをターゲットとする的確な治療法の開発を進めている。
現在の研究テーマは以下の１）～３）の３項目である。

１）循環器病の神経・体液性機序の解明とそれに基づく治療法開発

神経因子並びにペプチドを中心とした液性因子が、虚血性心・脳疾患、高血圧、糖尿病などの生活習慣病において、どのように循環・呼吸・代謝障害の病態に関わるかを主に小動物疾患モデルで調べている。また、その成果を臨床へのトランスレーショナルリサーチに展開している。研究には、以下の独自に開発した３つのin vivo測定法を用い、in vitroの分子解析法と結び付けている。

　①無麻酔・自由行動下小動物の循環、呼吸・代謝、神経機能のモニタリング法：

自由行動下ラットにおいて腎臓及び腰部交感神経活動及び血圧、血流などの血行動態指標を1ヶ月間慢性記録する技術を用いて、高血圧や心不全進行における神経性調節の役割を調べている。また、レーザー血流計と光ファイバー型血流プローブの慢性的埋め込み法を応用した心筋組織血流計測法や血圧・心拍数、一回換気量・呼吸数、酸素摂取量・二酸化炭素排出量、体温などを運動時に記録・解析できるシステムを開発し、無麻酔ラット・マウスに応用している。

　②自律神経機能および心筋障害を計測するためのマイクロダイアリシス法：

自律神経による循環器系調節機構の解明を目指し、マイクロダイアリシス法を用い、自律神経の伝達物質であるノルエピネフリン・アセチルコリンを生体内で直接モニターしている。心筋間質のノルエピネフリン・アセチルコリン濃度は、心臓局所における交感・副交感神経活動の指標となる。また、心筋間質のミオグロブン濃度は心筋細胞障害の指標となる。

　③SPring-8放射光Ｘ線画像による心血管機能のin vivo解析法（Circ Res 112(1): 209-221, 2013）：

放射光X線回折法による心筋収縮タンパク質分子動態のナノレベル画像解析法と心室圧－容積関係計測によるマクロレベル心臓機能解析法を麻酔下ラット拍動心臓に同時に応用する画期的な実験システムを世界に先駆け構築し、心臓に固有な収縮・拡張機構とその障害の根本的原因の解明を進めている。

独自のX線テレビシステムを麻酔下動物に応用した微小血管ネットワーク造影術を用いて、脳、腎、骨格筋などの臓器実質内の血管樹における血管運動・血流分配の可視化を行い、臓器循環調節の生理及び病態生理的機構を解析している。また、放射光高速微小血管造影法によって、高心拍数で拍動しているラット、マウスの心・肺の微小血管応答を観察し、種々病態下の血管内皮・平滑筋機能や血管新生を評価している。

２）生体ガスによる臨床診断法の開発と臨床応用

呼気ガスと皮膚ガスの基礎および臨床診断法を開発し、臨床応用へと実用化する。また、生体内活性酸素の非侵襲的検査法を開発し、循環器疾患診断法へと応用する。

３）循環器疾患関連タンパク質の構造生理的研究

循環器疾患に関連するタンパク質を対象に、主として放射光X線結晶構造解析法を用いたサブナノレベル分解能での構造活性相関の理解を進め、将来の創薬への基盤作りを目指している。

１）循環器病の神経・体液性機序の解明とそれに基づく治療法開発

●肺高血圧発症機構に関する研究：

慢性低酸素性肺高血圧症の肺血管リモデリング機構おいて、肺M2マクロファージの重要性が指摘されている。今回、M2マクロファージの肺への動員に関する分子機序として、IL6/Th17/IL21シグナリング機構が重要であることを低酸素肺高血圧マウスモデル並びにヒト肺高血圧肺組織を用いて明らかにした（PNAS, under revision）。

睡眠時無呼吸症候群（SAS）における肺高血圧発症機構を、間歇性低酸素負荷SASモデルラット（5%O2＋5%CO2の3分間負荷を3分毎に8時間/日繰り返す）に放射光肺微小血管造影を応用して調べた。その結果、肺に動員されたM1マクロファージが、β3/iNOSシグナリング機構を介して一酸化窒素を放出し、肺高血圧の進展を緩和することが分かった（PLOS ONE, under submission）。また、同時に、肺血管内皮でのβ2/eNOSシグナリングも活性化され、肺高血圧の進展に抑制的に働くことも分かった（PLOS ONE 2014 Oct 28; 9(10):e110693）。以上の肺でのβ受容体活性化に、中枢のβ1受容体を介した肺交感神経活動亢進が関与することが分かった（Basic Res. Cardiol. 2014 Sep; 109(5):432）。SASラットモデルでの肺高血圧発症には、交感神経活動意外に肺局所のarginaseの活性度も影響することを見出した。一般に年齢とともに肺arginaseの活性は高くなるが、老年のSASモデルラットではその活性増大が顕著で、肺でのNO産生・NO由来肺血管拡張が低下するため、若年のSASモデルラットより肺高血圧になりやすいことが判明した（Am J Respir Cell Mol Biol 2014 Dec 9. [Epub]）。

出生時の気道開通と肺循環開通が互いにどのような関係で確立するのかという問題については不明な点が多い。両者の正常な開通の障害は、ガス交換に重要な換気/血流比の異常や低酸素性肺血管収縮の発生に結びつく。今回、SPring-8放射光屈折コントラスト法をラビット新生児に応用して、両者の関係を解析したところ、片肺の気道開通のみで、両肺の肺循環が開通することを見出した。この所見は、従来の肺循環開通には先行した気道開通が必要であるという説を覆すもので、新生児肺高血圧のメカニズム解析に繋がると考えられた（J Appl Physiol 117(5): 535-543, 2014）。

●肺高血圧症にともなう右心室肥大・不全の進展機構に関する研究：

ラット肺高血圧・右心室肥大モデル（モノクロタリンあるいは慢性低酸素負荷）において、主に右心室を支配する右冠動脈の血管機能を、SPring-8放射光微小血管造影法で評価した。モノクロタリンモデルでは右冠動脈内皮機能の低下が検出されたが、慢性低酸素負荷モデルでは、むしろ機能亢進が見つかった。これらのモデルで、右心不全状態を作製し、血管機能がどのように変化するかを調べる予定である。

●高血圧発症における腎臓交感神経活動（RSNA）の役割：

教科書的には、RSNAの亢進は高血圧を引き起こすとされている。そこで、この説を検証するため、ダール食塩感受性高血圧ラット、脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)、腎動脈クリップ（2K1C）高血圧ラットモデルで、高血圧発症時のRSNAを1ヶ月間連続記録したが、どのモデルにおいても、血圧上昇過程でRSNAは変化しなかった。しかし、無呼吸症候群SASモデルラットでは、血圧上昇とRSNA上昇に相関が見られた。強い酸化ストレスによる高血圧発生にはRSNA増大が関与する可能性が示唆された。

●心疾患における心臓自律神経機能の解析：

心筋症モデルマウスでの研究

拡張型心筋症（DCM）ノックインモデルマウスに対するグレリンの皮下注射は、高頻度の突然死の抑制によって死亡率を大幅に低下させた。同時に、心臓リモデリングを抑制し、心臓収縮機能を大きく改善した。心拍変動解析より、この心臓保護作用は、グレリンが亢進した心臓交感神経活動を抑制し、低下した心臓迷走神経活動を増強することに起因する可能性が示された（Phamacol Res Perspect. 2014 Oct;2(5):e00064）。

そこで、まず、DCMモデルマウスの心臓迷走神経アセチルコリン放出能に異常があるかどうかを、マイクロダイアリシス法を用いて直接的に測定した。その結果、DCM マウスでは、迷走神経電気刺激に対するアセチルコリン放出は正常だが、中枢のα2アゴニスト刺激に対するアセチルコリン放出は低下していることが分かった。DCM マウスでは心臓迷走神経アセチルコリン放出の中枢性調節機構に障害があると考えられた。
次に、DCMマウスの心臓交感神経終末におけるノルエピネフリンの再取り込み機能を調べた。その結果、この機能にも障害が起きていることを見出した。

肥大型心筋症（HCM）についても研究を進めている。まず、HCMモデルマウス（心筋トロポニンT遺伝子の突然変異の一つで、ヒトで重篤なHCMを引き起こすミスセンスS179Fを導入したノックインマウス）の作製に成功した。このマウスは、若年突然死、左心室拡張機能低下、心筋ミオフィラメントCa2⁺感受性の上昇、心臓奇形、心臓求心性肥大、重度の錯綜配列及び顕著な間質繊維化などを呈し、ヒトHCMをよく再現した。今後、HCMとDCM間での心臓自律神経調節の違いを明らかにする予定である。

心臓虚血再潅流時の心筋障害病態に関する研究

心臓マイクロダイアリシス法を心臓虚血再灌流モデルラットに応用して、虚血再灌流時にカルシウム依存性カルパインが再灌流直後に活性化され、心筋細胞障害（ミオグロビン放出増大）が引き起こされること、さらにその障害の程度は先行する虚血時間の長さに依存することを明らかにした（Acta Physiol (Oxf). 210 (4): 823-831, 2014）。

また、心虚血再灌流時のhydroxy radical産生動態を明らかにすべく、同モデルラットの虚血部にtrapping agentとして4-HBAをマイクロダイアリスプローブ介して局所投与し、4-HBAのhydroxyl radicalとの反応物である3,4-DHBAをHPLCにて測定することにより、虚血部のhydroxyl radical産生をin vivoでモニターすることを可能にした。さらに、モノアミンオキシダーゼ阻害剤でモノアミン代謝を阻害すると、再灌流時のhydroxyl radical産生及び心筋障害が減少することも明らかにした。

心機能調節に重要な影響を与える心筋間質セロトニン動態を、マイクロダイアリシス法で心筋間質セロトニンとモノアミンオキシダーゼによる代謝物5-HIAAを同時測定することで、詳しく調べることを可能とした（Life Sci. 117: 33-39, 2014）。

心不全の神経性病態の解明とそれに基づく治療法開発に関する研究

心臓マイクロダイアリシス法をラットに応用して、交感神経活動と血中ノルエピネフリン濃度は生理的条件下ではよく相関するが、心不全のようなノルエピネフリン再取り込み機構が傷害されている病態下では、血中ノルエピネフリン濃度は交感神経活動を過大評価する可能性があることを明らかにした（Auton Neurosci 186: 62-68, 2014）。

また、同法をラビットに応用して、α2-agonistであるmedetomidineは、心臓および胃交感神経活動を低下させ、他方、心臓迷走神経活動を亢進、胃迷走神経活動を低下させることを見出した。この薬は、心不全に対するvagal activation therapyとして有効な治療薬となり得ると考えられた（Circ J 78: 1405-1413, 2014）。

●運動時の循環調節及び運動の肥満に対する効果に関する研究：

運動時の反射性心・循環応答に関する研究において、末梢感覚神経のうちTRPV1チャネルを発現する神経を麻痺させたところ、運動初期の心・循環応答には変化は認められなかったが、中盤以降の心拍数応答が著明に減弱した。したがってTRPV1チャネル発現神経は運動時の反射性心拍数調節に重要な役割を果たしている事が示唆された。

動が遺伝的な素因によって起こる肥満を抑制できるかは必ずしも明確でない。そこで、Ca²⁺結合蛋白質の一つであるNCS-1の遺伝子欠損マウス（脂肪酸代謝異常によって著しい肥満になる）と野生型で、長期間（8週間）の有酸素トレーニングの効果を比較した。その結果、トレーニングは野生型と同様KOマウスにおいても、白色および褐色脂肪細胞の脂肪滴を著明に減少させ、肥満を大幅に軽減することがわかった。以上の結果は、遺伝的に肥満体質になる場合でも、継続的な有酸素運動が肥満を解消するのに極めて有効であることを示している（2015年生理学会、論文準備中）。

●体外循環時の炎症反応と臓器障害：

体外循環は心臓手術及び心肺補助には欠かせない方法となっているが、体外循環時に起こる炎症反応は様々な合併症の根源とされており、抑制することが望まれている。ラット体外循環モデルを用いて、体外循環システムへ負荷する酸素ガス濃度を必要以上に上げないこと、また、水素ガスを同時に負荷することで体外循環に起因する炎症反応、臓器障害が強く抑制されることを示した（Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2014 Aug;2014:4483-4486）。

２）生体ガスによる臨床診断法の開発と臨床応用

●ヒト生体内における活性酸素種計測法の開発

生体ガスによる活性酸素種の間接的計測法の開発：

ヒト生体内活性酸素種の計測法は全く未開拓の領域である。水素分子がヒドロキシラジカルと反応に水を生成することを応用し、水素水飲用ならびに低濃度水素ガス吸入によるヒト生体内の間接的活性酸素推定法を評価した。いずれの方法においても生体内水素消費量は１μmol/min/m²であった。

皮膚ガス中活性酸素種の直接検出法の開発：

すでにLIF法により手掌表面からヒドロキシルラジカル（･OH）が放出されていることを報告してきたが、今回，大気圧イオン化質量分析を用いた方法によっても、さらに簡便かつ安全でリアルタイム計測可能な高感度ラジカル検出法として皮膚ガス中における･OHの検知の検出に成功した。このシステムを用い、OH･放出機序が水和クラスター形成に伴うものであることを明らかにした。

●腸内醗酵ガス成分の役割

腸内醗酵ガスによる抗酸化ストレス作用の解明：すでにターメリックなどの健康食品が呼気水素を上昇させることを報告しているが、玄米や牛乳摂取による嫌気性腸内醗酵により生体内水素濃度が上昇し、この水素分子が抗酸化力をもつ可能性があることを示唆する結果を得た。これらの研究成果から腸内醗酵を促進させる水素産生食品群にも抗酸化力があり、慢性長期的な生活習慣病ならびに循環器病の発症に関連する可能性があるとの仮説に到達し、水素発生を促進させる新規食品群の概念に到達した。本年度は食物繊維や牛乳乳製品に含まれる難消化性糖類の摂取に伴う水素発生と抗酸化能の関連についての実証研究を昨年度に引き続き実施した。

●呼気と皮膚ガスによる臨床診断法の開発と臨床応用

生体ガスと腸内ガスの関連：嫌気性醗酵に伴う水素分子のみならず糞便ガス中に高濃度で存在する硫化水素、二酸化硫黄、一酸化炭素、一酸化窒素は循環調節にも関与する重要なガス成分である。これらは糞便中からも大量に発生し循環器疾患にも関与する可能性がある。このため糞便から放出されるガス成分の評価法を確立した。

●心不全患者における呼気アセトンと重症度の関連

新規に「心不全における呼気低分子化合物の意義」の研究課題に関して倫理委員会の承認を得て、心不全患者における呼気成分の特徴について、病院心不全科と共同して探索的臨床研究を開始した。その結果、呼気アセトンが心不全の重症度に相関し、心不全のバイオマーカになることを明らかにし。

３）循環器疾患関連タンパク質の構造生理的研究

血栓止血機構の鍵となる様々なタンパク質分子について動物細胞あるいは昆虫培養細胞を用いた大量発現系の構築を進めている。得られたリコンビナントタンパク質を用いて血栓症などに関わる変異体の構造・機能解析を進め、血栓症発症機構との関わりを探究している。これまで行ってきた蛇毒プロテアーゼをモデルとしたADAM/ADAMTSファミリータンパク質の研究について、SpringerReferece（オンライン書籍 http://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007/978-94-007-6649-5_45-2）に総説として発表した。

1. Kawada T, Akiyama T, Shimizu S, Sata Y, Turner MJ, Shirai M and Sugimachi M. Acute effects of arterial baroreflex on sympathetic nerve activity and plasma norepinephrine concentration. Autonomic Neuroscience:Basic and Clinical. 186, 62-68, 2014.
2. Nagai H, Kuwahira I, Schwenke DO, Tsuchimochi H, Nara A, Inagaki T, Ogura S, Fujii Y, Umetani K, Shimosawa T, Yoshida KI, Pearson JT, Uemura K and Shirai M. beta(2)-Adrenergic Receptor-Dependent Attenuation of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction Prevents Progression of Pulmonary Arterial Hypertension in Intermittent Hypoxic Rats. PLOS ONE. 9, , 2014.
3. 下内 章人. Breath Analysis 2014. Aroma Research. 15, 270-271, 2014.
4. Sonobe T, Akiyama T, Du CK, Zhan DY and Shirai M. Contribution of calpain to myoglobin efflux from cardiomyocyte during ischemia and after reperfusion in anesthetized rat. Acta Physiologica. 210, 823-831, 2014.
5. Kuramoto K, Sakai F, Yoshinori N, Nakamura TY, Wakabayashi S, Kojidani T, Haraguchi T, Hirose F and Osumi T. Deficiency of a Lipid Droplet Protein, Perilipin 5, Suppresses Myocardial Lipid Accumulation, Thereby Preventing Type 1 Diabetes-Induced Heart Malfunction. Molecular and Cellular Biology. 34, 2721-2731, 2014.
6. Sakurai S, Kuroko Y, Shimizu S, Kawada T, Akiyama T, Yamazaki T, Sugimachi M and Sano S. Effects of intravenous cariporide on release of norepinephrine and myoglobin during myocardial ischemia/reperfusion in rabbits. Life Sciences. 114, 102-106, 2014.
7. Yamauchi K, Tsuchimochi H, Stone AJ, Stocker SD and Kaufman MP. Increased dietary salt intake enhances the exercise pressor reflex. American journal of physiology-Heart and circulatory physiology . 306, 450-454, 2014.
8. Shimizu S, Akiyama T, Kawada T, Kamiya A, Turner MJ, Yamamoto H, Shishido T, Shirai M and Sugimachi M. Medetomidine Suppresses Cardiac and Gastric Sympathetic Nerve Activities but Selectively Activates Cardiac Vagus Nerve. Circulation Journal. 78, 1405-1413, 2014.
9. Du CK, Zhan DY, Akiyama T, Sonobe T, Inagaki T and Shirai M. Myocardial interstitial serotonin and its major metabolite, 5-hydroxyindole acetic acid levels determined by microdialysis technique in rat heart. Life Sciences. 117, 33-39, 2014.
10. Shimada-Shimizu N, Hisamitsu T, Nakamura TY Hirayama, N and Wakabayashi S. Na+/H+ exchanger 1 is regulated via its lipid-interacting domain which functions as a molecular switch: A pharmacological approach using indolocarbazole compounds. Molecular Pharmacology. 85, 18-28, 2014.
11. Nara A, Nagai H, Shintani-Ishida K, Ogura S, Shimosawa T, Kuwahira I, Shirai M and Yoshida K. Pulmonary arterial hypertension in rats due to aged related arginase activation in intermittent hypoxia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , , 2014.
12. Shirai M, Tsuchimochi H, Nagai H, Gray E, Pearson JT, Sonobe T, Yoshimoto M, Inagaki T, Fujii Y, Umetani K, Kuwahira I and Schwenke DO. Pulmonary vascular tone is dependent on the central modulation of sympathetic nerve activity following chronic intermittent hypoxia. Basic Research in Cardiology. 109, 432, 2014.
13. Nakamura TY and Wakabayashi S. Role of Neuronal Calcium Sensor-1 as a Regulator of Immature Heart Function and Cardiac Hypertrophy. Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery. 30, 224-231, 2014.
14. Takeda S. Structure-Function Relationship of Modular Domains of P-III Class Snake Venom Metalloproteinases. Toxinology. , 1-22, 2014.
15. Du CK, Zhan DY, Morimoto S, Akiyama T, Schwenke DO, Hosoda H, Kangawa K and Shirai M. Survival benefit of ghrelin in the heart failure due to dilated cardiomyopathy. Pharmacology Research & Perspectives. 2, e00064, 2014.
16. Lang JAR, Pearson JT, te Pas AB, Wallace MJ, Siew ML, Kitchen MJ, Fouras A, Lewis RA, Wheeler KI, Polglase GR, Shirai M, Sonobe T and Hooper SB. Ventilation/perfusion mismatch during lung aeration at birth. Journal of Applied Physiology. 117, 535-543, 2014.
17. 下内 章人, 宮道 隆, 神野 直哉, 水上 智恵, 近藤 孝晴. 玄米，白米ならびに糠の摂食による呼気水素の変動比較. 安定同位体と生体ガス. 6, 33-38, 2014.
18. 下内 章人, 近藤 孝晴. 呼気ガス医療診断の現状と課題，今後の展望. 応用物理. 83, 26-32, 2014.
19. 武田 壮一. 蛇毒メタロプロテアーゼ. 日本の結晶学（II)-その輝かしい発展‐（日本結晶学会編）. , 374, 2014.
20. 下内 章人. 生体内活性酸素が生体ガス分析からみえてくる. 医療ガス情報ファイル. 13, 4-11, 2014.
21. 下内 章人. 分析化学から臨床研究，医療応用への道のり. ぶんせき. 12, 699, 2014.