生化学部
研究活動の概要

生化学部では、細胞間情報伝達に関わり、生体のホメオスタシスを維持するために重要な役割を果している未知の生理活性物質を検索し、それによる未知の情報伝達および制御機構を解明することに取り組んでいる。新規ペプチドの探索は容易ではないが、その発見は非常に大きなインパクトを与えると共に全く異なった視点での研究の展開をもたらす。実際、我々のグループによる心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）（1984年）や脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）（1988年）の発見によって、それまでポンプとしてのみ機能すると考えられていた心臓が、ホルモンを分泌する内分泌器官として位置付けられた。現在ANPとBNPは、心不全の治療および診断薬として臨床応用されている。一方、柳沢、眞崎らによる血管内皮細胞からのエンドセリン（1988年）の発見や、脳から発見したC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）（1990年）が内皮細胞やマクロファージから分泌されるため、血管壁もペプチドホルモンを分泌する内分泌組織として捉えられている。CNPは血管の局所因子としてリモデリング抑制効果を示すことから、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）後の再狭窄や動脈硬化の発症において重要な役割が示唆され、臨床応用が期待されている。また、心筋梗塞後の線維芽細胞の産生するCNPの線維化抑制作用も注目されている。このように新しい循環調節因子の発見は、それまで考えも及ばなかった制御系の存在を明示すると共に、新しい診断・治療薬の開発に繋がることも期待できる。

上記のような研究の経緯を背景として、生化学部では生理活性ペプチドの探索を最優先課題としている。また、そのための新しい探索法、活性測定法や精製および構造解析法の開発を常に行っている。その結果として、CNPに続く新しい循環調節ペプチドとしての“アドレノメデュリンおよびPAMPの発見”（1993年）や“グレリンの発見”（1999年）、オーファン受容体GPR66（FM3）の内因性リガンドとしての“ニューロメジンUの同定”（2000年）、さらに“ニューロメジンSの発見”（2005年）などに繋がったと考えている。これらのペプチドについては、遺伝子発現および分泌調節、作用機序や新たな生理機能の解明などの基礎的研究を進めると共に、当センター研究所、病院およびセンター外の多数の研究グループと連携して、病態生理的意義の解明や新しい診断、治療薬としての臨床応用を目指しての研究も進めている。

一方、上記新規ペプチドの他にも、当研究グループで既に発見またはクローニングした骨形成タンパク質（BMP-3b）、視床下部ペプチドであるPACAP（Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide）、グアニリンペプチドファミリーなどについても、新たな機能解析や病態生理的意義の解明に関しての研究を進めている。

○生化学部では、新規物質を基盤として、具体的には主に以下のテーマの研究を行っている。

  1. 新規成長ホルモン分泌促進ペプチド; グレリン(Ghrelin) に関する研究
  2. アドレノメデュリン(Adrenomedullin : AM)とPAMPによる新しい循環調節機構の解明
  3. ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー(ANP, BNP, CNP) の新たな機能解明
  4. 摂食抑制ペプチド“ニューロメジンU”の新たな機能解明に関する研究
  5. 新規神経ペプチド“ニューロメジンS”の機能解明に関する研究
  6. BMP-3b(Bone Morphogenetic Protein-3b)の新たな機能に関する研究
  7. 新しい活性検出法を用いた新規生理活性ペプチドの探索に関する研究
2012年の主な研究成果

A）グレリン（Ghrelin）に関する研究

○1999年に当研究室で発見したグレリンについて、これまでに成長ホルモン分泌促進以外にも、食欲促進、エネルギー代謝調節、循環調節など多様な機能により生体のホメオスタシスの維持に働くホルモンであることを示してきた。また、血中グレリンは、心不全、慢性閉塞性肺疾患(COPD)や拒食症におけるカヘキシアなどの低栄養状態で高値、肥満で低値を示し、BMIと負の相関を示すこと、さらに慢性心不全患者へのグレリンの慢性投与は、左室機能や運動耐用能を改善することを明らかにし、新たな心不全治療薬としての可能性を示した。

①今回、カヘキシアを伴う33例のCOPD患者に対し、多施設共同ランダム化二重盲検試験によるグレリンの有効性の検討を行った結果、3週間のグレリン投与群(2μg/kg)はプラセボ群と比較して、６分間歩行にて評価した運動能について有意差は認めなかったが改善傾向を認め、自覚症状や呼吸筋力の有意な改善を認めた。グレリンはカヘキシアを伴うCOPDに対して新たな治療薬となりうる可能性が示された。

②また、進行期食道ガン患者の化学療法中のグレリンの効果について、ランダム化第２相試験を大阪大学との共同で行った結果、シスプラチン投与１週間の期間にグレリン(3μg/kg)を１日２回投与した群は、質問紙による食欲スコアが有意に高く、シスプラチン化学療法による食欲不振や嘔気などの副作用を軽減させることが明らかになった。

○グレリンは、主に胃底腺の内分泌細胞であるX/A like cellで合成・分泌される。胃から分泌されたグレリンは、胃周辺の迷走神経末端に作用して、Nodose Ganglia（迷走神経節）および孤束核を介して情報を中枢に伝達する経路が主要であることを明らかにし、さらに孤束核から視床下部へはノルアドレナリン神経系を介して情報が伝達され、生理作用を発現することを明らかにしてきた。また、グレリンの分泌制御に自律神経系が関与することを示してきた。

③今回、冠動脈結紮心筋梗塞モデルラットに対し、発症後30分以内の超急性期にグレリン（150μg/kg、皮下注）を単回投与したところ、生食投与群と比較して２週間以内の急性期死亡率と交感神経活動亢進、心機能障害が有意に抑制されていることが明らかとなった。

④さらに、内因性グレリンの急性心筋梗塞モデルにおける病態生理的意義を解明するため、グレリン欠損マウスに心筋梗塞モデルを作製し評価した結果、グレリン欠損マウスにおける死亡率や急性期の不整脈は、野生型に比し有意に増加していた。グレリンの心筋梗塞急性期における致死性不整脈死抑制効果は、交感神経活性抑制および副交感神経活性亢進によるものと推察された。以上より、グレリンの急性心筋梗塞に対する新たな治療薬としての可能性が示された。

○グレリンの分子進化や構造と活性の関連を明らかにするため、非哺乳類（鳥類、両生類、爬虫類および魚類）のグレリンの構造と機能解析を進めている。これまで、両生類では脂肪酸修飾された3番目のアミノ酸が哺乳類のSer からThrに置換していること、魚類のグレリンはC末端がアミド化されていることなど、哺乳類にはないユニークな構造をもつこと、またグレリンが魚類、両生類、鳥類でも下垂体から成長ホルモン分泌を促したり、摂食を調節することなど、グレリンの分子進化や構造、活性について特異かつ重要な知見を得ている。

⑤今回、マグログレリンの構造、キンギョの摂食・情動行動には４種類あるグレリン受容体（GHS-Ra）の中で少なくともGHS-R2a-1が関与すること、ニワトリヒナにおけるグレリンによる摂食抑制作用にはGABAが一部関与すること、ニジマスとキンギョの摘出胃腸管においてグレリンは収縮運動に関与しないことを明らかにした。

B）アドレノメデュリン（AM）に関する研究

○アドレノメデュリン（AM）について、AMトランスジェニックマウスおよびノックアウトマウス、疾患モデル動物、培養細胞などを用いての検討により、病態生理的意義を明らかにしている。特に、AM長期投与は悪性高血圧ラットの生命予後を改善すること、心筋梗塞後のリモデリングを抑制すること、AMの急性期短期投与は虚血再灌流傷害を著明に抑制すること、in vitroにおいてdoxorubicinによる心筋アポトーシスを抑制すること、下肢虚血モデルラットへのAMと骨髄由来単核球細胞移植の併用が血管新生効果を増強することなど、AMは種々の病態において保護的に働くことを明らかにしている。急性心筋梗塞患者に対しては、AMの急性期投与による有用性を示し、新たな急性心筋梗塞への治療薬としてのAMの可能性を提示した。

①今回、動物モデルで血管新生作用を有するAMを用いて、内科薬物治療困難な下肢末梢動脈閉塞症例に対するAMによる血管新生治療の臨床評価を再生医療部および血管内科部門と共同で進め、現在症例を蓄積している。

C）ナトリウム利尿ペプチド・ファミリー（ANP, BNP, CNP）に関する研究

○３種のナトリウム利尿ペプチド（NP）のうち、ANP, BNPは心筋細胞より分泌され、主に循環ホルモンとして機能する。ANP・BNPの機能的共通受容体であるGC-Aは、血管内皮細胞に豊富に存在し、ANP・BNPが血管恒常性維持ホルモンとして作用している可能性がある。

①今回、B16マウスメラノーマ細胞（本細胞株はGC-Aを発現していない）をマウス尾静脈から注入後、2週間観察する肺転移モデルを作製し、血管内皮特異的GC-Aノックアウトマウスを用いて実験を行ったところ、肺転移が有意に増加し、逆に血管内皮特異的GC-A過剰発現マウスでは、肺転移が有意に減少した。以上より、ANP/GC-Aシグナルが宿主側の血管内皮細胞に作用し、癌転移予防効果を有する可能性があることが示された。

D）ニューロメジンU（NMU）とニューロメジンS（NMS）の新たな機能解明に関する研究

○ニューロメジンU（NMU）とニューロメジンS（NMS）は、我々が発見した神経ペプチドであり、同一の活性部位を持つ関連ペプチドである。これまで、NMUの機能として、レプチンとは異なった経路での摂食抑制による中枢性摂食・エネルギー代謝調節、ストレス反応の仲介機能、サーカディアンリズムの形成、侵害反射、肥満細胞の直接活性化による炎症反応の促進、骨再生の中枢性調節、消化管の恒常性維持、血圧・心拍数増加による循環調節を示した。一方、NMSもサーカディアンリズムの調節、摂食抑制、バソプッレシンを介した利尿調節、オキシトシンを介した乳汁分泌促進、交感神経を介した循環調節に関与することを示した。また、NMSの中枢作用はNMUに比して、約10倍強力であった。

①これまで、NMUについては脳内分布が示されており、NMUが持つ機能との関連が示されている。一方、NMSについては脳内分布が不明であり、機能との関連も明らかになっていない。そこで、ラット脳でのNMSの分布をラジオイムノアッセイで検討した。NMS遺伝子発現は視床下部でのみ観察されたが、NMSペプチドは、脳幹でも視床下部と同じレベルで豊富に存在していた。これは、視床下部に存在するNMS産生細胞からの神経線維投射が、中枢性循環調節で重要な脳幹へ到達していることを示しており、NMSが循環調節に寄与している可能性を示唆している。

E）BMP-3b(Bone Morphogenetic Protein-3b)の新たな機能に関する研究

○BMP-3bは、我々が骨組織より1996年に同定したタンパク質である。BMP-3bは、構造上BMPファミリーに属するが、他のBMPファミリーとは異なる独自の作用を有しており、骨形成抑制作用や初期胚発生過程における、内在性の脳・神経誘導因子（頭部誘導因子）としての機能を明らかにしてきた。BMP-3bは、心・血管系組織やそれらと関連性が高い脂肪組織においても高レベルで存在しており、これら組織における新たな機能解明を目指した研究を推進している。

①BMP-3bの脂肪組織での機能解析の結果、BMP-3bは脂肪細胞において分化抑制作用を示し、肥満モデル動物でもその量が増加し、新たなアディポサイトカインとしての機能が明らかとなった。BMP-3bを脂肪組織特異的に過剰発現するマウスを作製し、肥満に対する効果を検討したところ、脂肪組織量の減少を伴う体重低下の表現型を呈し、抗肥満作用が判明した。更に、その作用機序として、受容体（ALK4/ActRIIA）と細胞内情報伝達系（Smad2/3）を見出した。

F）新しい活性検出法を用いた新規生理活性ペプチドの探索に関する研究

○生理活性ペプチドは、それぞれ特異的な受容体を介して細胞に情報を伝達しており、受容体の多くはGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。現在、リガンドが不明なため機能が知られてないGPCR遺伝子（オーファンGPCR）は数多く存在し、この内因性リガンドの探索による新規生理活性ペプチドの同定が期待されている。近年、生化学部ではこの手法を用いてグレリンの発見やニューロメジンU、ニューロメジンSの同定に成功している。新たな生理活性ペプチドを探索するために、新しい活性検出法の開発を進めている。

①前年度は、リガンド刺激によって生じる細胞の微小形態変化についてインピーダンスを指標に検出する方法（CellKeyシステム）を開発した。今回、オーファンGPCRの内因性リガンド探索にCellKeyシステムを導入し、未知の生理活性ペプチド探索を実施した。標的オーファンGPCR発現細胞において、ラット組織抽出物の添加により、特異的なインピーダンスの増加が検出された。この活性を指標に精製を進めた結果、複数のペプチドの同定に成功した。

研究業績
  1. Akamizu T., Sakura N., Shigematsu Y., Tajima G., Ohtake A., Hosoda H., Iwakura H., Ariyasu H. and Kangawa K. Analysis of plasma ghrelin in patients with medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency and glutaric aciduria type II. Eur J Endocrinol 166, 235-40, 2012.
  2. Ariyasu H., Yamada G., Iwakura H., Akamizu T., Kangawa K. and Nakao K. Transgenic mice overexpressing ghrelin or ghrelin analog. Methods Enzymol 514, 371-7, 2012.
  3. Bando M., Iwakura H., Ariyasu H., Hosoda H., Yamada G., Hosoda K., Adachi S., Nakao K., Kangawa K. and Akamizu T. Transgenic overexpression of intraislet ghrelin does not affect insulin secretion or glucose metabolism in vivo. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 302, E403-E408, 2012.
  4. Fukuhara S., Simmons S., Kawamura S., Inoue A., Orba Y., Tokudome T., Sunden Y., Arai Y., Moriwaki K., Ishida J., Uemura A., Kiyonari H., Abe T., Fukamizu A., Hirashima M., Sawa H., Aoki J., Ishii M. and Mochizuki N. The sphingosine-1-phosphate transporter Spns2 expressed on endothelial cells regulates lymphocyte trafficking in mice. J Clin Invest 122, 1416-26, 2012.
  5. Fukumori R., Mita T., Sugino T., Hasegawa Y., Kojima M., Kangawa K., Obitsu T. and Taniguchi K. Effects of glucose and volatile fatty acids on blood ghrelin concentrations in calves before and after weaning. Journal of Animal Science 90, 4839-4845, 2012.
  6. Fukumori R., Sugino T., Shingu H., Moriya N., Hasegawa Y., Kojima M., Kangawa K., Obitsu T., Kushibiki S. and Taniguchi K. Effects of calcium salts of long-chain fatty acids and rumen-protected methionine on plasma concentrations of ghrelin, glucagon-like peptide-1 (7 to 36) amide and pancreatic hormones in lactating cows. Domest Anim Endocrinol 42, 74-82, 2012.
  7. Hamada N., Nishi Y., Tajiri Y., Setoyama K., Kamimura R., Miyahara K., Nuruki N., Hosoda H., Kangawa K., Kojima M. and Mifune H. Disrupted regulation of ghrelin production under antihypertensive treatment in spontaneously hypertensive rats. Circ J 76, 1423-9, 2012.
  8. Hino J., Miyazawa T., Miyazato M. and Kangawa K. Bone morphogenetic protein-3b (BMP-3b) is expressed in adipocytes and inhibits adipogenesis as a unique complex. International Journal of Obesity 36, 725-734, 2012.
  9. Hiura Y., Takiguchi S., Yamamoto K., Takahashi T., Kurokawa Y., Yamasaki M., Nakajima K., Miyata H., Fujiwara Y., Mori M., Kangawa K. and Doki Y. Effects of ghrelin administration during chemotherapy with advanced esophageal cancer patients: a prospective, randomized, placebo-controlled phase 2 study. Cancer 118, 4785-94, 2012.
  10. Hosoda H. and Kangawa K. Standard sample collections for blood ghrelin measurements. Methods Enzymol 514, 113-26, 2012.
  11. Hotta M., Ohwada R., Akamizu T., Shibasaki T. and Kangawa K. Therapeutic potential of ghrelin in restricting-type anorexia nervosa. Methods Enzymol 514, 381-98, 2012.
  12. Iwasaki E., Suzuki H., Masaoka T., Nishizawa T., Hosoda H., Kangawa K. and Hibi T. Enhanced gastric ghrelin production and secretion in rats with gastric outlet obstruction. Dig Dis Sci 57, 858-64, 2012.
  13. Jonaidi H., Abbassi L., Yaghoobi M. M., Kaiya H., Denbow D. M., Kamali Y. and Shojaei B. The role of GABAergic system on the inhibitory effect of ghrelin on food intake in neonatal chicks. Neurosci Lett 520, 82-6, 2012.
  14. Ju Y., Mizutani T., Imamichi Y., Yazawa T., Matsumura T., Kawabe S., Kanno M., Umezawa A., Kangawa K. and Miyamoto K. Nuclear receptor 5A (NR5A) family regulates 5-aminolevulinic acid synthase 1 (ALAS1) gene expression in steroidogenic cells. Endocrinology 153, 5522-34, 2012.
  15. Kaiya H., Hosoda H., Kangawa K. and Miyazato M. Determination of nonmammalian ghrelin. Methods Enzymol 514, 75-87, 2012.
  16. Kishimoto I., Tokudome T., Hosoda H., Miyazato M. and Kangawa K. Ghrelin and cardiovascular diseases. J Cardiol 59, 8-13, 2012.
  17. Kitamura K., Kangawa K., Kawamoto M., Ichiki Y., Nakamura S., Matsuo H. and Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. 1993. Biochem Biophys Res Commun 425, 548-55, 2012.
  18. Kojima M., Hosoda H. and Kangawa K. Purification of rat and human ghrelins. Methods Enzymol 514, 45-61, 2012.
  19. Mao Y. J., Tokudome T., Otani K., Kishimoto I., Nakanishi M., Hosoda H., Miyazato M. and Kangawa K. Ghrelin Prevents Incidence of Malignant Arrhythmia after Acute Myocardial Infarction through Vagal Afferent Nerves. Endocrinology 153, 3426-3434, 2012.
  20. Matsumoto Y., Otsuka F., Hino J., Miyoshi T., Takano M., Miyazato M., Makino H. and Kangawa K. Bone morphogenetic protein-3b (BMP-3b) inhibits osteoblast differentiation via Smad2/3 pathway by counteracting Smad1/5/8 signaling. Mol Cell Endocrinol 350, 78-86, 2012.
  21. Mifune H., Nishi Y., Tajiri Y., Masuyama T., Hosoda H., Kangawa K. and Kojima M. Increased production of active ghrelin is relevant to hyperphagia in nonobese spontaneously diabetic Torii rats. Metabolism-Clinical and Experimental 61, 491-495, 2012.
  22. Miki K., Maekura R., Nagaya N., Nakazato M., Kimura H., Murakami S., Ohnishi S., Hiraga T., Miki M., Kitada S., Yoshimura K., Tateishi Y., Arimura Y., Matsumoto N., Yoshikawa M., Yamahara K. and Kangawa K. Ghrelin treatment of cachectic patients with chronic obstructive pulmonary disease: a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. PLoS One 7, e35708, 2012.
  23. Mogami S., Suzuki H., Fukuhara S., Matsuzaki J., Kangawa K. and Hibi T. Reduced ghrelin production induced anorexia after rat gastric ischemia and reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 302, G359-64, 2012.
  24. Morozumi N., Sato S., Yoshida S., Yamaki A., Furuya M., Inomata N., Ohnuma N., Minamitake Y., Ohsuye K. and Kangawa K. A new strategy for metabolic stabilization of motilin using the C-terminal part of ghrelin. Peptides 33, 279-284, 2012.
  25. Ogawa Y., Mukoyama M., Yokoi H., Kasahara M., Mori K., Kato Y., Kuwabara T., Imamaki H., Kawanishi T., Koga K., Ishii A., Tokudome T., Kishimoto I., Sugawara A. and Nakao K. Natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase-A protects podocytes from aldosterone-induced glomerular injury. J Am Soc Nephrol 23, 1198-209, 2012.
  26. Ohshima M., Yamahara K., Ishikane S., Harada K., Tsuda H., Otani K., Taguchi A., Miyazato M., Katsuragi S., Yoshimatsu J., Kodama M., Kangawa K. and Ikeda T. Systemic transplantation of allogenic fetal membrane-derived mesenchymal stem cells suppresses Th1 and Th17 T cell responses in experimental autoimmune myocarditis. J Mol Cell Cardiol 53, 420-8, 2012.
  27. Saito H., Ikeda R., Inoue K., Nagata S., Kitamura K., Minamino N., Kangawa K. and Miyata A. Neuromedin B stimulates proliferation of mouse chondrogenic cell line ATDC5. Peptides 36, 299-302, 2012.
  28. Sato T., Nakamura Y., Shiimura Y., Ohgusu H., Kangawa K. and Kojima M. Structure, regulation and function of ghrelin. J Biochem 151, 119-28, 2012.
  29. Schwenke D. O., Tokudome T., Kishimoto I., Horio T., Cragg P. A., Shirai M. and Kangawa K. One dose of ghrelin prevents the acute and sustained increase in cardiac sympathetic tone after myocardial infarction. Endocrinology 153, 2436-43, 2012.
  30. Suda A., Kaiya H., Nikaido H., Shiozawa S., Mishiro K. and Ando H. Identification and gene expression analyses of ghrelin in the stomach of Pacific bluefin tuna (Thunnus orientalis). Gen Comp Endocrinol 178, 89-97, 2012.
  31. Sugiyama M., Yamaki A., Furuya M., Inomata N., Minamitake Y., Ohsuye K. and Kangawa K. Ghrelin improves body weight loss and skeletal muscle catabolism associated with angiotensin II-induced cachexia in mice. Regul Pept 178, 21-8, 2012.
  32. Takiguchi S., Adachi S., Yamamoto K., Morii E., Miyata H., Nakajima K., Yamasaki M., Kangawa K., Mori M. and Doki Y. Mapping analysis of ghrelin producing cells in the human stomach associated with chronic gastritis and early cancers. Dig Dis Sci 57, 1238-46, 2012.
  33. Yahashi S., Kang K. S., Kaiya H. and Matsuda K. GHRP-6 mimics ghrelin-induced stimulation of food intake and suppression of locomotor activity in goldfish. Peptides 34, 324-8, 2012.
  34. Yamaguchi Y., Kaiya H., Konno N., Iwata E., Miyazato M., Uchiyama M., Bell J. D., Toop T., Donald J. A., Brenner S., Venkatesh B. and Hyodo S. The fifth neurohypophysial hormone receptor is structurally related to the V2-type receptor but functionally similar to V1-type receptors. General and Comparative Endocrinology 178, 519-528, 2012.
  35. Yoshida M., Miyazato M. and Kangawa K. Orphan GPCRs and Methods for Identifying Their Ligands. Ghrelin 514, 33-44, 2012.
  36. Akamizu T. and Kangawa K. The physiological significance and potential clinical applications of ghrelin. European Journal of Internal Medicine 23, 2012.
  37. Ida T., Takahashi T., Tominaga H., Sato T., Sano H., Kume K., Ozaki M., Hiraguchi T., Shiotani H., Terajima S., Nakamura Y., Mori K., Yoshida M., Kato J., Murakami N., Miyazato M., Kangawa K. and Kojima M. Isolation of the bioactive peptides CCHamide-1 and CCHamide-2 from Drosophila and their putative role in appetite regulation as ligands for G protein-coupled receptors. Frontiers in Endocrinology 3, 177, 2012.
  38. Kitazawa T., Itoh K., Yaosaka N., Maruyama K., Matsuda K., Teraoka H. and Kaiya H. Ghrelin does not affect gastrointestinal contractility in rainbow trout and goldfish in vitro. General and comparative Endocrinology 178, 539-545, 2012.
  39. Mori M., Mori K., Ida T., Sato T., Kojima M., Miyazato M. and Kangawa K. Different distribution of neuromedin S and its mRNA in the rat brain: NMS peptide is present not only in the hypothalamus as the mRNA, but also in the brainstem. Frontiers in Endocrinology 3, 152, 2012.
  40. 野尻 崇. COPD患者における長時間作用型抗コリン薬Tiotropiumの心血管系への影響. 薬理と治療 40, 367-377, 2012.