国立循環器病研究センター研究所

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組織・各部の紹介　分子薬理部

情報制御研究室

情報制御研究室は循環器病の発生機序の解明、診断・治療法の開発を目的として、その基盤となる生理活性ペプチドやバイオマーカーなどの探索を行っています。生理活性ペプチドは、心血管系において情報伝達や機能制御に重要な役割を果たしています。新規生理活性ペプチドを発見し、その生理作用や作用機序を解明し、病態生理的役割や変動を解明することにより、診断・治療法の開発の研究基盤を構築していきたいと考えています。

１．ペプチドーム解析に基づいた生理活性ペプチドの探索

生体内ではタンパク質の切断が常に起こり、ペプチドとよばれる分子量１万以下の分子が生成しています。これらの中には生体内の情報伝達制御物質として働くものがあり、生理活性ペプチドと呼ばれています。生理活性ペプチドの例としてはインスリンが有名ですが、循環器疾患の領域ではナトリウム利尿ペプチド類が治療や診断に応用されています。生理活性ペプチドは生体内で産生され、有害事象がほとんど認められないため、創薬の標的として魅力的な物質です。しかし、現在一般的に実施されているプロテオーム解析の手法では生理活性ペプチドは解析できません。分子薬理部では、組織や細胞で産生されるペプチドの一斉解析（ペプチドーム解析）を提唱し、生理活性ペプチドの発見に応用してきました。

液体クロマトグラフィーと質量分析計を用いて多数のペプチドの配列を同定することができます。分子薬理部は、その中から配列の保存性や特徴などに基づいて生理活性ペプチド候補を見出す方法を世界に先駆けて確立してきました。候補ペプチドは合成して、活性を検証します（図１）。この方法により、新しい活性ペプチドを発見することに成功しています（詳細は 生理活性ペプチドの機能解明 を参照して下さい）。

（A）図１．新しい生理活性ペプチドの探索手順

図１．新しい生理活性ペプチドの探索手順

生理活性ペプチドはタンパク質の単なる分解物ではなく、プロテアーゼにより特定の部位で切断を受けて生成されます。ペプチドーム解析で同定したペプチド群の配列から内在性ペプチドを推定し、図中の選定基準に従って生理活性ペプチド候補を選定します。選定したペプチドやこれに対する抗体を用いて、生物活性のスクリーニング、内在性の確認、産生細胞や標的細胞の同定等を行い、新しい活性ペプチドの発見へと研究を展開していきます。

関連成果等

  1. Minamino N, Tanaka J, Kuwahara H, Kihara T, Satomi Y, Matsubae M, Takao T: Determination of endogenous peptides in the porcine brain: possible construction of peptidome, a fact database for endogenous peptides. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 792: 33-48, 2003.
  2. 南野直人、桑原大幹、松井泰子、木原孝洋、磯山－田中純子：ペプチドーム研究の最前線、化学と生物 42: 162-169, 2004.
  3. Yamaguchi H, Sasaki K, Satomi Y, Shimbara T, Kageyama H, Mondal MS, Toshinai K, Date Y, González LJ, Shioda S, Takao T, Nakazato M, Minamino N: Peptidomic identification and biological validation of neuroendocrine regulatory peptide-1 and -2. J Biol Chem 282: 26354-26360, 2007.
  4. 佐々木一樹、南野直人：生理活性ペプチド探索のためのペプチドミクス研究、「ペプチドと創薬」（寒川賢治、南野直人編），Medical Do, 2007，51-56頁.
  5. 南野直人、佐々木一樹：ペプチドーム解析と NERPの発見、循環器科64: 476-485, 2008.
  6. Sasaki K, Satomi Y, Takao T, Minamino N: Snapshot peptidomics of the regulated secretory pathway. Mol Cell Proteomics 8: 1638-1647, 2009.
  7. Mishiro-Sato E, Sasaki K, Matsuo T, Kageyama H, Yamaguchi H, Date Y, Matsubara M, Ishizu T, Yoshizawa-Kumagaye K, Satomi Y, Takao T, Shioda S, Nakazato M, Minamino N: Distribution of neuroendocrine regulatory peptide-1 and -2, and proteolytic processing of their precursor VGF protein in the rat. J Neurochem 114: 1097-1106, 2010.
  8. 佐々木一樹、南野直人：生理活性ペプチド探索のためのペプチドミクス、実験医学増刊「創薬・タンパク質研究のためのプロテオミクス解析」（小田吉哉、長野光司編），羊土社, 2010，162-167頁.
  9. Sasaki K, Takahashi N, Satoh M, Yamasaki M, Minamino N: A peptidomics strategy for discovering endogenous bioactive peptides. J Proteome Res 9: 5047-5052, 2010.
  10. Osaki T, Sasaki K, Minamino N: Peptidomics-based discovery of an antimicrobial Peptide derived from insulin-like growth factor-binding protein 5. J Proteome Res 10: 1870-1880, 2011.

２．生理活性ペプチドの機能解明

強い降圧作用を有する循環調節ペプチド、アドレノメデュリン（AM）に加え、我々が新たに発見したカルシトニン受容体刺激ペプチド（CRSP-1）や神経内分泌制御ペプチド（NERP-1及びNERP-2）について薬理学的、生理学的な機能解析を行い、これらの生理活性ペプチドに関する情報を集積し、臨床応用へと展開することを目標に研究を進めています（図２）。

AMは副腎髄質細胞が産生する降圧ペプチドと考えられていましたが、血管の平滑筋細胞や内皮細胞、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、血球系細胞など様々な細胞から産生・分泌されることを明らかにしました。特に、線維芽細胞で、炎症性サイトカインや内毒素、低酸素などの刺激、細胞傷害により産生が顕著に増加することや、マクロファージや線維芽細胞などで炎症性サイトカイン産生を抑制する事実は、AMが従来のホルモンや循環調節ペプチドの枠組みを超えた新しい生理活性ペプチドであることを示しています。

ブタから単離したCRSP-1は、カルシトニン（CT）より100倍も強くカルシトニン受容体を刺激する興味深いペプチドで、ラットへの静脈投与で血中カルシウム濃度低下、中枢投与で摂食抑制、体温上昇、鎮痛作用、腎臓でのイオン代謝制御といったCT同様の作用が見られます。CT受容体のリガンドが見出されていなかった中枢神経系で豊富に存在する点が、CRSPの大きな特徴です。

NERP-1、NERP-2はペプチドーム解析により発見されたペプチドで、視床下部・下垂体後葉系を中心とした脳神経系に豊富に存在し、特に室傍核や視索上核の多くの神経細胞でバソプレッシン（AVP）と共存しています。ラットへの中枢投与実験の結果から、AVP分泌を制御する内在性物質と考えられます。また、NERP-2はオレキシン神経系を介して摂食やエネルギー代謝に関わることを最近明らかにしました。

（B）図２．生理活性ペプチドの発見、発現部位、活性、機能

図２．生理活性ペプチドの発見、発現部位、活性、機能

過去10年間に、我々が研究を行ってきた代表的な生理活性ペプチドであるアドレノメデュリン、カルシトニン受容体刺激ペプチド-1、神経内分泌制御ペプチド１及び２の研究成果についてまとめました。

生理活性ペプチドは、生体内の様々な組織、細胞で産生され、その機能も多岐に亘っています。そのため、発現、活性、機能に関する幅広い情報の収集が不可欠であり、それらの情報の蓄積によって臨床応用への道筋を見出すことができます。

関連成果等

  1. Isumi Y, Kubo A, Katafuchi T, Kangawa K, Minamino N: Adrenomedullin suppresses interleukin-1β-induced tumor necrosis factor-α production in Swiss 3T3 cells. FEBS Lett 463: 110-114, 1999.
  2. Tomoda Y, Kikumoto K, Isumi Y, Katafuchi T, Tanaka A, Kangawa K, Dohi K, Minamino N: Cardiac fibroblasts are major production and target cells of adrenomedullin in the heart in vitro. Cardiovasc Res 49: 721-730, 2001.
  3. Tomoda Y, Isumi Y, Katafuchi T, Minamino N: Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells. Peptides 22: 1783-1794, 2001.
  4. Katafuchi T, Kikumoto K, Hamano K, Kangawa K, Matsuo H, Minamino N: Calcitonin receptor-stimulating peptide, a new member of the calcitonin gene-related peptide family. Its isolation from porcine brain, structure, tissue distribution, and biological activity. J Biol Chem 278: 12046-12054, 2003.
  5. Katafuchi T, Hamano K, Kikumoto K, Minamino N: Identification of second and third calcitonin receptor-stimulating peptides in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun 308: 445-451, 2003.
  6. Hamano K, Katafuchi T, Kikumoto K, Minamino N: Calcitonin receptor-stimulating peptide-1 regulates ion transport and growth of renal epithelial cell line LLC-PK1. Biochem Biophys Res Commun 330: 75-80, 2005.
  7. Sawada H, Yamaguchi H, Shimbara T, Toshinai K, Mondal MS, Date Y, Murakami N, Katafuchi T, Minamino N, Nunoi H, Nakazato M: Central effects of calcitonin receptor-stimulating peptide-1 on energy homeostasis in rats. Endocrinology 147: 2043-2050, 2006.
  8. Yamaguchi H, Sasaki K, Satomi Y, Shimbara T, Kageyama H, Mondal MS, Toshinai K, Date Y, González LJ, Shioda S, Takao T, Nakazato M, Minamino N: Peptidomic identification and biological validation of neuroendocrine regulatory peptide-1 and -2. J Biol Chem 282: 26354-26360, 2007.　（テーマＡにも記載）
  9. Osaki T, Katafuchi T, Minamino N: Genomic and expression analysis of canine calcitonin receptor-stimulating peptides and calcitonin/calcitonin gene-related peptide. J Biochem 144: 419-430, 2008.
  10. Katafuchi T, Yasue H, Osaki T, Minamino N: Calcitonin receptor-stimulating peptide: Its evolutionary and functional relationship with calcitonin/calcitonin gene-related peptide based on gene structure. Peptides 30: 1753-1762, 2009.
  11. Matsuo T, Yamaguchi H, Kageyama H, Sasaki K, Shioda S, Minamino N, Nakazato M: Localization of neuroendocrine regulatory peptide-1 and -2 in human tissues. Regul Pept 163: 43-48, 2010.
  12. Toshinai K, Yamaguchi H, Kageyama H, Matsuo T, Koshinaka K, Sasaki K, Shioda S, Minamino N, Nakazato M: Neuroendocrine regulatory peptide-2 regulates feeding behavior via the orexin system in the hypothalamus. Am J Physiol Endocrinol Metab, 299: E394-401, 2010.
  13. Fujihara H, Sasaki K, Mishiro-Sato E, Ohbuchi T, Dayanithi G, Yamasaki M, Ueta Y, Minamino N: Molecular characterization and biological function of neuroendocrine regulatory peptide-3 in the rat. Endocrinology 153: 1377-1386, 2012.

３．生理活性ペプチドの診断・治療法への応用

生理活性ペプチドは多様な機能を発揮し、循環器系、内分泌系をはじめとする生体の恒常性の維持に不可欠であるため、これらの生理・病態生理学的役割を解明することにより、診断・治療法に応用できると考えられます。これまで研究対象としてきたナトリウム利尿ペプチド類（ANP、BNP、CNP）のうち、ANPは心不全の治療薬、BNPは心不全の診断薬として実用化されています。ペプチドの臨床応用をさらに進めるため、機能が明らかになったペプチドに関して血中濃度や血液中の分子型の変動などを解析し、各種疾患や病態との関連を調べています。また、機能や疾患での変動に基づいて適応症例を選択し、治療法や創薬への応用も検討しています。独法化によりトランスレーショナル研究の推進が本研究所の使命となったため、病院と共同して応用研究を推進しています。

アドレノメデュリン（AM）に関する研究では、内分泌系、神経系、循環器系に止まらず、線維芽細胞をはじめほぼ全ての生体構成細胞でAMが産生され、炎症や細胞傷害により産生が著しく亢進されること、実際に全身性炎症反応症例で血中濃度が上昇することを示しました。

また、BNPに関する研究では、心不全のゴールデンマーカーとして日常診療に不可欠な指標である血中BNP濃度が、BNP前駆体由来の多様な分子の集合体を測定しており、個々の分子濃度を測定することにより、心機能の詳細な情報が得られることを明らかにしました。

図３．心臓、血管における種々の循環調節ペプチドの産生細胞と機能

図３．心臓、血管における種々の循環調節ペプチドの産生細胞と機能

ナトリウム利尿ペプチド、AM、エンドセリン（ET）などの循環調節ペプチドは、心血管系の細胞に作用するだけではなく、心血管系細胞でも活発に産生されています。心臓で産生されるANP、BNPは血液中に分泌され、血管を拡張し、腎臓では利尿を促進しレニン・アンジオテンシン系を抑制して、血圧、体液量を効率的に減少させます。また、心組織のリモデリング制御因子として、肥大や線維化を抑制します。AMやETは、局所因子として血管トーヌス調節に不可欠ですが、多種類の細胞で産生され、炎症や細胞増殖の制御などの機能も果たします。CNPも神経ペプチドとしての中枢作用以外に、血管内皮細胞で産生され平滑筋細胞の増殖を抑制します。このように生理活性ペプチドは全身の様々な細胞で産生され、協調的に作用することにより、生体の恒常性を維持していると考えられます。各種疾患や病態におけるペプチドの機能や変動を詳細に解析することにより、創薬や診断・治療法への応用が可能になると考えられます。

関連成果等

  1. Ueda S, Nishio K, Minamino N, Kubo A, Akai Y, Kangawa K, Matsuo H, Fujimura Y, Yoshioka A, Masui K, Doi N, Murao Y, Miyamoto S: Increased plasma levels of adrenomedullin in patients with systemic inflammatory response syndrome. Am J Resp Crit Care Med 160: 132-136, 1999.
  2. Nagata D, Hirata Y, Suzuki E, Kakoki M, Hayakawa H, Goto A, Ishimitsu T, Minamino N, Ono Y, Kangawa K Omata M: Hypoxia-induced adrenomedullin production in the kidney. Kidney Int 55: 1259-1267, 1999.
  3. Kubo A, Nishitani Y, Minamino N, Kikumoto K, Kurioka H, Nishino T, Iwano M, Kangawa K and Dohi K: Adrenomedullin gene transcription is decreased in peripheral blood mononuclear cells of patients with IgA nephropathy. Nephron 85: 201-206, 2000.
  4. Robertson CL, Minamino N, Ruppel RA, Kangawa K, Wisniewski SR, Tsuji T, Janesko KL, Ohta H, Adelson PD, Marion DW, Kochanek PM: Increased adrenomedullin in cerebrospinal fluid after traumatic brain injury in infants and children. J Neurotrauma 18: 861-868, 2001.
  5. Kubo A, Isumi Y, Ishizaka Y, Tomoda Y, Kangawa K, Dohi K, Matsuo H, Minamino N: C-type natriuretic peptide is synthesized and secreted from leukemia cell lines, peripheral blood cells, and peritoneal macrophages. Exp Hematol 29: 609-615, 2001.
  6. Sugo S, Minamino N, Shoji H, Isumi Y, Nakao K, Kangawa K, Matsuo H: Regulation of endothelin-1 production in cultured rat vascular smooth muscle cells. J Cardiovasc Pharmacol 37: 25-40, 2001.
  7. Minamino N, Kikumoto K, Isumi Y: Regulation of adrenomedullin expression and release. Microsc Res Tech 57: 28-39, 2002.
  8. Minamino N, Horio T, Nishikimi T: Natriuretic peptides in the cardiovascular system. “Handbook of the Biologically Active Peptides”Ed. A.J. Kastin (Academic Press, San Diego, 2006) pp. 1199-1207.
  9. Nishikimi T, Minamino N, Horii K and Matsuoka H: Do commercially available assay kits for B-type natriuretic peptide measure pro-BNP1-108, as well as BNP1-32? Hypertension 50: e163, 2007.
  10. Nishikimi T, Minamino N, Ikeda M, Takeda Y, Tadokoro K, Shibasaki I, Fukuda H, Horiuchi Y, Oikawa S, Ieiri T, Matsubara M, Ishimitsu T: Diversity of molecular forms of plasma brain natriuretic peptide in heart failure_-different proBNP-108 to BNP-32 ratios in atrial and ventricular overload. Heart 96: 432-439, 2010.

４．多層的疾患オミックス解析における、プロテオーム情報に基づく創薬標的の網羅的探索を目指した研究

健康長寿社会を実現することは国民の最大の願いです。その最大の障害となっている心血管疾患、がん、アレルギー疾患、認知症、生活習慣病等について、革新的な予防・診断・治療法の開発を可能とする創薬標的候補分子の発見を目指して、多施設で共同研究を行っています。

ヒトゲノム配列の公開以来、生体分子を網羅的に解析するオミックス技術が進歩を遂げ、ゲノム・トランスクリプトーム・プロテオームなどの各階層で研究が進められてきましたが、十分な成果が得られていません。そこで厚生労働省に所属する高度医療研究センターと各オミックス解析の研究者とが共同研究体を構築し、集中的な研究（多層的疾患オミックス解析研究）を行うことになりました。具体的には、死亡率や罹患率が高く、国民生活の質を低下させている主要な11疾患を対象として、同じ病変部組織を用いてオミックス解析を行い、疾患発症や病態形成のメカニズムに基づいた新しい創薬標的候補分子の発見を目指しています。その過程で得られたデータは、疾患横断的なデータベースに収録、公開し、創薬研究などに活用される予定です。

分子薬理部ではプロテオーム解析を担当します。収集された組織試料について2-Dimensional Image Converted Analysis of Liquid chromatography-mass spectrometry（2DICAL）法を中心としたプロテオーム解析を実施し、予防・診断・治療法の開発に利用できる創薬標的候補タンパク質の発見を目指します。

（D）図４．多層的疾患オミックス解析における、プロテオーム情報に基づく創薬標的の網羅的探索を目指した研究

図４．多層的疾患オミックス解析における、プロテオーム情報に基づく創薬標的の網羅的探索を目指した研究

高度医療研究センター（循環器病、がん、精神神経、国際、成育、長寿）が専門とする疾患について厳選した臨床試料（病変組織と対照組織など）と臨床情報を収集し、各機関でバイオバンクなどを構築します。各機関より試料・情報の提供を受けて、当センターと国立がん研究センターがプロテオーム解析を行います。同じ試料が他の解析拠点にも送られ、４種のオミックス解析が実施されます。これらのデータを統合して比較・解析を行い、新たな創薬標的候補分子を見出すことを目標としています。得られた結果は、世界の創薬研究者がアクセス可能なデータベースとして公開する予定です。

最終更新日 2012年05月14日

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