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分子病態部

2014年の業績

研究活動の概要

分子病態部は4研究室から構成される。病院との連携を密にして循環器疾患の克服に向けた血栓研究と脳循環研究を、タンパク質・遺伝子のレベルから疾患モデル動物を用いた個体レベルまで、幅広い手法を用いて研究している。分子病態部は、1)血栓形成の研究、2)血管壁細胞の研究、3)脳循環代謝研究、を進めている。

1)血栓形成の研究は、1-1) ADAMTS13の研究を通した血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)の研究、1-2) 非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)に関する研究、1-3) 血小板インテグリンの活性化の研究を通した血小板凝集機構に関する研究、1-4) 日本人の静脈血栓塞栓症・血栓性素因の研究、1-5) 抗血栓薬の遺伝薬理学研究、1-6) 血栓症に関わる臨床研究、を進めている。

1-1)ADAMTS13の研究を通した血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)の研究
TTPは血小板減少と溶血性貧血を示し細小血管に血小板血栓が生じる難治性疾患である。本疾患はADAMTS13活性が先天性もしくは後天性の要因により著減(10%以下)し、超高分子量フォンビルブランド因子マルチマーが血中に蓄積し、これによって血小板血栓が生じる。私達はこれまでに、先天性TTP患者のADAMTS13遺伝子の解析と組み換え変異体の解析、日本人に高頻度に見られるADAMTS13 P475S変異の同定、新規高感度迅速ADAMTS13活性測定法の開発と知的所有権の確保、ADAMTS13遺伝子欠損マウスの作製と表現型の解析、ADAMTS13のC末端ドメイン欠如マウスの作成と抗血栓能の解析、ADAMTS13の立体構造決定、先天性TTP患者数の推定などを行ってきた。これらの研究成果はTTPの病因解明に貢献している。私達は先天性TTPの遺伝子解析における中核的施設として機能しており、これまでに国内では47家系の先天性TTP患者53名の遺伝子解析を行った。今年度もTTPの研究を継続した。

1-2)非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)に関する研究
非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)は、血小板減少、溶血性貧血、急性腎障害を示し、補体系因子の遺伝子変異をもつ症例が半数以上を占める。私達は全国で同定されたaHUSの遺伝子解析を進め、これまでに39症例の遺伝子解析を行い、60%強の患者に遺伝子変異を認めている。私達は厚生労働科学研究費研究班を通して、全国のaHUSの遺伝子解析の拠点施設として機能している。2013年9月、aHUSの治療薬として抗C5抗体が本邦で承認された。この治療薬が登場したことにより、今後、益々aHUS患者の遺伝子解析の重要性が増すと予想される。厚生労働科学研究費研究班と協力し、国内のaHUS解析を推し進める。

1-3)血小板インテグリンの活性化の研究を通した血小板凝集機構に関する研究
動脈血栓症は血小板凝集が大きな役割を果たす。血小板の各種受容体のなかでも、血小板インテグリンは安定な血小板血栓の形成に中心的な役割を果たすことが明らかになっており、血小板インテグリンの活性化の解明は、新規抗血小板薬の創薬に結びつく。私達は血小板インテグリンの活性化メカニズムの解明を目指して研究を進め、CHO細胞にゲノム網羅的変異を導入する手法を用いて、2009年に血小板のインサイドアウトシグナルに関わる因子としてIntegrin-linked kinaseを同定した。2013年により詳細なメカニズムを報告し、研究を継続している。

1-4)日本人の静脈血栓塞栓症・血栓性素因の研究
静脈血栓塞栓症の発症には、遺伝的素因が関わることは広く知られている。遺伝的な血栓性素因として、白人には凝固第V因子Leiden変異とプロトロンビンG20210A変異が知られているが、両変異は日本人には認められない。私達は、2006年に日本人の約55人に1人に見られるプロテインS K196E変異が、静脈血栓塞栓症のリスク(オッズ比、3.74-8.56、変異Eアレル頻度、0.089)であることを明らかにした。その後、研究を継続し、本変異のヘテロ接合体者の血中プロテインS 抗凝固活性は平均で16%低いこと(2006年)、静脈血栓症患者173名中13名が本変異ヘテロ接合体、2名がホモ接合体であること(2009年)、妊娠産褥期の静脈血栓症患者18名中、2名が本変異ヘテロ接合体であること(2011年)、中国人と韓国人には存在せず日本人にだけ見られる変異であること(2013年)などを報告し、エビデンスを積み上げている。日本人に見られるプロテインS K196E変異を含めた先天性血栓性素因の研究を継続している。

1-5)抗血栓薬の遺伝薬理学研究
2004年にビタミンK還元酵素VKORC1がクローニングされた。私達は、この酵素の遺伝子多型がワルファリンの投与量に影響すると考え、ワルファリン投与量と遺伝子多型の関連解析を行い、VKORC1遺伝子多型がワルファリン投与量の個人差の約8%を説明することを報告した(2007年)。その後、ワルファリンの遺伝薬理学的研究を継続し、腎機能との関連を明らかにした。また、同じ頃、抗血小板薬アスピリン服用に血栓症の再発を伴う不応症が報告された(2002年、2003年)。アスピリンが効かない患者がいるという報告は、間接的にチエノピリジン系抗血小板薬の優位性を示すこととなり、極めてナイーブな面を持つ。そこで、公的資金だけを用いて、抗血小板薬アスピリンの不応症の研究を行う多施設前向き臨床試験を行った(ProGEAR研究、医薬基盤研究所基礎研究推進事業採択:2006年-2010年)。この研究を進めている最中に、チエノピリジン系抗血小板薬クロピドグレルは、CYP2C19の機能消失変異保有者では血栓再発率が高いとの論文が発表された(2009年1月)。これをもとに、米国FDAはクロピドグレル投与患者にCYP2C19遺伝子多型のタイピングを薦める勧告が出された。日本人にはこの機能消失変異が高率(約60%が変異を保有)に見られるので、慢性期の脳梗塞患者を対象に、抗血小板薬クロピドグレルの前向き薬理遺伝学研究を行っている(Cognac研究)。急性期の脳梗塞患者を対象にしたPRAISE研究も進めている。これらの研究は、病院の研究グループと共同で行っている。

1-6)血栓症に関わる臨床研究
妊娠産褥期は血栓症が見られる。妊娠時の凝固亢進状態は出産時の出血を止めるために合目的であるが、妊婦の血栓症や母体と胎児を繋ぐ血管の循環不全などは、抑制されるべきである。周産期婦人科および臨床検査部と共同で、i) 血栓性素因に関する研究、ii) 妊娠時のヘパリン療法による抗凝固療法のモニタリングに関する研究を行っている。妊婦では凝固因子量が増加するため、APTTでのヘパリンモニタリングに難渋する場合がある。私達は妊娠時のヘパリンによるAPTTの短縮は、凝固第VIII因子の増加が最も大きい要因であるを明らかにした。また、iii) 新規経口抗凝固薬ダビガトランの凝固系マーカーへの影響の検討、iv) 新規経口第Xa因子阻害薬の凝固系マーカーへの影響の検討、v) 急性期脳卒中例の診断・病態解明に対する新たな血中バイオマーカ―の探索に関する研究、vi) HIT抗体に関する研究、を病院の研究グループとともに進めている。

2)血管壁細胞の研究として、ホモシステインで誘導される遺伝子HerpおよびNDRG1、そのホモログであるNDRG4、小胞体膜のトランスロコンであるDerlinの研究を行っている。ホモシステインは血管内皮細胞の変化を起こす血栓性刺激物質であり、私達はこれらの遺伝子を血管内皮細胞のホモシステイン処理で誘導される遺伝子として単離した(1996年)。ホモシステインは側鎖にSH基を持つので、細胞の小胞体内腔に構造不全タンパク質が蓄積し、細胞は小胞体ストレス状態を起こしていた。小胞体ストレスは虚血、動脈硬化、糖尿病などに広く見られるストレスとして、大変注目を浴びている。私たちは、Herp、Ndrg1、Ndrg4、Derlin1, Derlin3の5種の遺伝子欠損マウスを作製しその表現型の研究を通して、小胞体ストレスの研究を進めている。Ndrg1欠損マウスは末梢神経変性疾患Charcot-Marie-Tooth病4D型の病態を示した(2004年)。Ndrg4欠損マウスは局所脳虚血再灌流に脆弱性を示した(2011年)。Herp欠損マウスは耐糖能低下および局所脳虚血再灌流への脆弱性を示した(2012年)。Derlin1欠損マウスは致死であった(2012年)。Derlin3欠損マウスは見かけ上は正常であった(2012年)。これらの研究を継続している。

3)脳循環代謝研究では、脳血管攣縮の成因の解明、虚血性脳卒中時に生じる虚血性ペナンブラ領域の病態解明、一過性局所脳虚血モデルの開発、虚血耐性の誘導と認知症の予防や改善効果を有する脳由来神経栄養因子(BDNF)の脳内産生を促進させる医療機器の開発、およびBDNF産生促進物質の探索を行っている。局所脳虚血モデルに関しては、再現性の高い、治療効果の判定法として有用なラット局所脳虚血モデルを開発し(2001年)、その後、マウスモデルへと発展させた(2003年)。同マウスモデルは、その後の各種ノックアウト動物の神経脆弱性の判定に用い、脆弱性関連遺伝子を報告した(2011年、2012年)。さらに、脳虚血マウスを、無血操作/無血手術による脳梗塞モデルへと進化させ(2014)、虚血負荷後の脳梗塞巣の再現性向上と致死率低下を達成した。連続的に生じさせた拡延性抑制現象が脳内BDNFを増加させ、脳梗塞体積を縮小させることの発見(1998年)をきっかけに、脳内BDNFの産生増加法の開発に着手し、特定の電位刺激が脳内のBDNF産生を促進し、脳梗塞を縮小させ(2005年)、また、記憶力を増強させることを見出した(2008年)。さらに、虚血耐性誘導時の観察において、脳皮質表面(軟膜下層)に神経幹細胞様動態を示すグリア系細胞の活性化と、その後の神経新生現象を見出した(2009年)。脳血管攣縮の成因解明に関しては、血管炎に集積するマクロファージから産生される血小板由来成長因子(PDGF)が遅発性の血管収縮を生じさせ、脳血管攣縮の原因と成りえることを明らかとした(2011年)。また、既存薬剤の脳保護作用の探索に関しては、Ⅱ糖尿病薬(DPP-4阻害剤)が脳内BDNFの産生を促進し、脳保護作用を示すことを明らかとした(2013年)。さらに、特定電圧の生体(ヒト)への印加刺激が、緩やかな抗肥満効果を示すことを報告した(2013年)。

2014年の主な研究成果

1)血栓研究

1-1) ADAMTS13の研究を通した血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)の研究
私達はADAMTS13の蛍光合成基質としてFRETS-VWF73を開発した。これを用いる活性測定法を国内および海外企業へ技術移転し、本法はADAMTS13測定の世界的なスタンダードになっている。また、先天性TTP患者の遺伝子解析を行い、診断に対するサポートや発症要因の解明にを継続して行った。また、今年度は電気刺激誘発下大静脈障害モデルを用いてADAMTS13欠損マウスに静脈血栓症を誘発し、野生型マウスと比較解析し、本欠損マウスは動脈血栓だけでなく静脈血栓形成も亢進することを明らかにした。また、組換えヒトADAMTS13投与により欠損マウスの血栓重量は野生型マウスと同等にまで改善した。これらの結果から、フォンビルブランド因子依存性の血小板接着は動脈血栓症のみならず静脈血栓症の発症に関わり、ADAMTS13はこの抑制に働くことが示唆された。本研究の成果はThromb Haemost誌に受理された。宮田はThe 18th International Vascular Biology Meetingおよび2014 Suzhou International Symposium on Basic and Translational Vascular Researchにて講演を行った。小亀浩市室長はThe Annual Scientific and Standardization Committee Meetingのvon Willebrand Factor 部会でGenetics, Genomics and Population Studiesセッションの座長を務めた。

1-2) 非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)に関する研究
非典型溶血性尿毒症症候群(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS)の多くは補体活性の制御異常により発症し、約半数の症例で補体第二経路に関わる因子の遺伝子変異が認められる。奈良県立医科大学輸血部では血栓性微小血管障害症患者の診断・登録を行い、先天性aHUS疑い患者を同定している。今回、三重大学病院で同定された6家系の8名のaHUS患者の遺伝子解析を行い、患者全員にC3:I1157T変異を同定した。本変異はC3上の補体制御因子H因子の結合部位に位置しているので、変異C3から生じるC3bはH因子を結合できず、補体因子が自己細胞を攻撃して腎障害などの疾患に繋がると考えられ、本変異はaHUS発症の素因と考えられた。本研究は、三重大学和田英夫准教授との共同研究である。本研究成果はInt J Hematol誌に掲載された。

1-3) 血小板インテグリンの活性化の研究を通した血小板凝集機構に関する研究
血小板凝集のメカニズムは動脈閉塞症を理解し、その予防と治療にとって重要である。血小板凝集反応にかかわる因子の単離同定を発現クローニングの手法を用いて進め、血小板インテグリンの活性化を制御する因子としてIntegrin-linked kinase (ILK) を同定した。本研究を継続し、より詳細なメカニズムの解明を2013年に報告した。

1-4) 日本人の静脈血栓塞栓症・血栓性素因の研究
本年は東アジア人の静脈血栓症の遺伝的背景に関する英文および日本語の総説を発表した。英文総説は"Dysfunction of protein C anticoagulant system, main genetic risk factor for venous thromboembolism in Northeast Asians"と題して Journal of Thrombosis and Thrombolysis 誌に掲載された。これは中国General Hospital of Chinese People's Liberation Army、Tong Yin博士との共同研究である。日本語総説は日本血液学会雑誌である「臨床血液」に「日本人における先天性血栓性素因 欧米との比較」と題して発表した。

1-5) 抗血栓薬の遺伝薬理学研究
抗血小板薬クロピドグレルの効果はCYP2C19遺伝子多型で影響を受けることが知られており、日本人は白人種に比べ、CYP2C19遺伝子の変異型保有者は多い。そこで、脳神経内科および外部機関と多施設共同で、慢性期脳梗塞患者を対象に、クロピドグレル服薬患者のADP惹起血小板凝集能、VASPリン酸化能、CYP2C19遺伝子多型を測定し、2年間の追跡イベントとの関連を調べる研究(Cognac研究)を行っており、イベント収集が終了し、CYP1C19遺伝子型との解析を行った。また、急性期脳梗塞患者を対象に抗血小板反応性モニタリングの臨床的意義を検討する研究を開始し、約100名の患者登録を進めた(PRAISE研究)。

1-6) 血栓症に関わる臨床研究
本年は大阪府下の4施設共同で、不育症患者330人を登録し、3種の凝固制御因子(プロテインC、プロテインS、アンチトロンビン)の塩基再配列解析を行った。その結果、凝固制御因子の遺伝子変異は不育症患者の3%にしか見られないことから、不育症の主な原因ではないことを明らかにした。また、日本人の55人に1人に見られる静脈血栓塞栓症のリスク(オッズ比、3.74-8.56)であるプロテインS K196E変異は、不育症の危険因子ではないことを明らかにした。本研究は、周産期婦人科根木玲子医長、吉松淳部長との共同研究である。本研究成果はThrombosis Research 誌に掲載された。

2)血管壁細胞の研究

Herp、NDRG1、そのホモログであるNDRG4、小胞体膜のトランスロコンであるDerlinのノックアウトマウスの研究を進めている。

3)脳循環代謝研究

局所脳虚血後に生じる血液脳関門の破綻は、血管性脳浮腫の原因となり、脳梗塞後遺症に負の影響を与える。当施設研究所、放射線医学部との共同研究により、マウスに対して一過性局所脳虚血を負荷し、その直後より連続的に7テスラMRI撮像装置を用いて、虚血後急性期病態を画像化し、その経時的な変化を解析、比較した。その結果、虚血性ペナンブラ、および、その周辺に超急性期血管性浮腫が観察され、その発現は、虚血中心部に先駆けて生じることが明らかとなった。また、血管性浮腫とは別の細胞性浮腫も観察された。血管性浮腫による水分量の増加は、最終的に生き残る脳領域にも超急性期より観察され、同変化は、一過性局所脳虚血後の生存維持に寄与する良性脳浮腫と考えられた。以上は、米国神経科学学会にて報告した。また、慢性疼痛治療剤としてすでに用いられている臨床薬剤を一定期間投与することで、マウス脳内のBDNF産生量が増加し、一過性局所脳虚血後に生じる脳梗塞の進展が抑制され、さらに、用量依存性に身体能(瞬発)力が高まり、正常マウスの記憶力(spatial learning and memory)を向上させることを明らかとし、米国神経科学学会にて報告した。

急性期意識障害における覚醒機構抑制機構の解明に関して、頭部外傷後に必発する神経/グリア細胞集団の一過性脱分極現象である拡延性抑制(spreading depolarization)が有する意識障害(脳波の持続的徐派化)作用の存在を明らかとし、国内医学雑誌、および、第23回日本意識障害学会にて、その一部を報告した。

研究業績

  1. Morioka M, Matsumoto M, Saito M, Kokame K, Miyata T and Fujimura Y. A first bout of thrombotic thrombocytopenic purpura triggered by herpes simplex infection in a 45-year-old nulliparous female with Upshaw-Schulman syndrome. Journal of Blood Transfusion. 12, s153-s155, 2014.
  2. Eura Y, Kokame K, Takafuta T, Tanaka R, Kobayashi H, Ishida F, Hisanaga S, Matsumoto M, Fujimura Y and Miyata T. Candidate gene analysis using genomic quantitative PCR: identification of ADAMTS13 large deletions in two patients with Upshaw-Schulman syndrome. Molecular Genetics & Genomic Medicine. 2, 240-244, 2014.
  3. Matsukuma E, Imamura A, Iwata Y, Takeuchi T, Yoshida Y, Fujimura Y, Fan Xinping, Miyata T and Kuwahara T. Postoperative atypical hemolytic uremic syndrome associated with complement C3 mutation. Case Reports in Nephrology. , , 2014.
  4. Yang D, Nakajo Y, Iihara K, Kataoka H, Nakagawara J, Zhao Q and Yanamoto H. An Integrated Stroke Model with a Consistent Penumbra for the Assessment of Neuroprotective Interventions. European Neurology. 71, 4-18, 2014.
  5. Matsumoto T, Fan XP, Ishikawa E, Ito M, Amano K, Toyoda H, Komada Y, Ohishi K, Katayama N, Yoshida Y, Matsumoto M, Fujimura Y, Ikejiri M, Wada H and Miyata T. Analysis of patients with atypical hemolytic uremic syndrome treated at the Mie University Hospital: concentration of C3 p.I1157T mutation. International Journal of Hematology. 100, 444-449, 2014.
  6. Okata T, Toyoda K, Okamoto A, Miyata T, Nagatsuka K and Minematsu K. Anticoagulation intensity of rivaroxaban for stroke patients at a special low dosage in Japan. PLOS ONE. 9, e113641, 2014.
  7. Tanaka H, Tenkumo C, Mori N, Kokame K, Fujimura Y and Hata T. Case of maternal and fetal deaths due to severe congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) during pregnancy. The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 40, 247-249, 2014.
  8. Matsui H, Takeda M, Soejima K, Matsunari Y, Kasuda S, Ono S, Nishio K, Shima M, Banno F, Miyata T and Sugimoto M. Contribution of ADAMTS13 to the better cell engraftment efficacy in mouse model of bone marrow transplantation. Haematologica. 99, e211-e213, 2014.
  9. Yin T and Miyata T. Dysfunction of protein C anticoagulant system, main genetic risk factor for venous thromboembolism in Northeast Asians. Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 37, 56-65, 2014.
  10. Larkin J, Chen BS, Shi XH, Mishima T, Kokame K, Barak Y and Sadovsky Y. NDRG1 Deficiency Attenuates Fetal Growth and the Intrauterine Response to Hypoxic Injury. Endocrinology. 155, 1099-1106, 2014.
  11. Neki R, Miyata T, Fujita T, Kokame K, Fujita D, Isaka S, Ikeda T and Yoshimatsu J. Nonsynonymous mutations in three anticoagulant genes in Japanese patients with adverse pregnancy outcomes. Thrombosis Research. 133, 914-918, 2014.
  12. 小亀 浩市, 樋口(江浦) 由佳. Upshaw-Schulman症候群のADAMTS13遺伝子解析. 細胞. 46, 61-63, 2014.
  13. 宮田 敏行, 坂野 史明. VI凝固線溶系 3.血栓症と炎症におけるポリリン酸の役割. Annual Review 血液2014. , 216-223, 2014.
  14. 樋口(江浦) 由佳, 小亀 浩市, 宮田 敏行. ターゲット領域の異常を見逃さないゲノム定量PCR法の確立、ダイレクトシークエンシング法の弱点を補う解析方法として. 日本血栓止血学会誌. 25, 615-618, 2014.
  15. 田中 智貴, 長束 一行, 宮田 敏行. ファーマコゲノミクス. 分子脳血管病. 13, 42-46, 2014.
  16. 宮田 敏行, 水口 純, 鈴木 敦夫, 小嶋 哲人. プロテインC/プロテインSの基礎. 日本血栓止血学会誌. 25, 40-47, 2014.
  17. 柳本 広二. 意識障害の成因と神経系脱分極現象. 洛和会病院医学雑誌. 25, 23-38, 2014.
  18. 藤村 吉博, 松本 雅則, 石西 綾美, 八木 秀男, 小亀 浩市, 宮田 敏行. 血栓性血小板減少性紫斑病. 臨床血液. 55, 93-104, 2014.
  19. 宮田 敏行, 田嶌 優子. 第1章 血栓・止血異常症を理解するために 凝固反応を理解する. よくわかる血栓・止血異常の診療. , 4-13, 2014.
  20. 宮田 敏行, 丸山 慶子. 日本人における先天性血栓性素因、欧米との比較. 臨床血液. 55, 908-916, 2014.
  21. 吉田 瑶子, 藤村 吉博, 宮田 敏行. 非典型HUSにおける補体異常とその解析. 細胞. 46, 7-10, 2014.
  22. 宮田 敏行, 中村 敏子. 補体反応. 救急・集中治療. 26, 668-673, 2014.

最終更新日 2016年07月01日

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